甲基叔丁基醚對(duì)斑馬魚及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的毒性效應(yīng)

洪文旭 熊法德 曾序春

摘要[目的]研究甲基叔丁基醚（MTBE）對(duì)斑馬魚和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的毒性作用及氧化應(yīng)激效應(yīng)，為其科學(xué)、合理應(yīng)用提供依據(jù)。[方法]應(yīng)用半靜態(tài)試驗(yàn)法研究不同濃度MTBE對(duì)斑馬魚的急性毒性效應(yīng)，以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞為模型，分析不同濃度MTBE對(duì)CHO細(xì)胞增殖水平和氧化應(yīng)激相關(guān)酶活力水平的影響。[結(jié)果]MTBE對(duì)斑馬魚的48 h LC50值為71.5 mg/L；在細(xì)胞試驗(yàn)中，當(dāng)MTBE暴露濃度高于5.0 mmol/L時(shí)，CHO細(xì)胞增殖水平受到明顯抑制（P<0.05）；當(dāng)MTBE暴露濃度達(dá)到50.0 mmol/L時(shí)，SOD活力明顯上升（P<0.05）。當(dāng)MTBE濃度達(dá)到25.0 mmol/L時(shí)，CAT活力達(dá)到最大值且與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）；當(dāng)MTBE濃度達(dá)到25.0 mmol/L時(shí)，CHO處理組GSH-Px活力明顯上升（P<0.05）。[結(jié)論]MTBE暴露可以誘導(dǎo)斑馬魚和CHO細(xì)胞的毒性作用，而氧化應(yīng)激酶活力水平的改變可能是MTBE毒性作用之一。

關(guān)鍵詞 甲基叔丁基醚；斑馬魚；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞；毒性作用；氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào) R99 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）02-0004-03

Abstract[Objective] To study the toxicological effects and oxidative stress of methy tertbutyl ether （MTBE） on zebra fish and Chinese hamster ovary （CHO） cells and provide basis for its scientific and reasonable application.[Method] Acute toxic effects of MTBE on zebra fish were studied by static experiment method.By using CHO cells as test model，the effects of different concentrations of MTBE on proliferation level and the activities of enzymes related with oxidative stress of CHO cells were analyzed.[Result] LC50 of MTBE to zebra fish at 48 h was 71.5 mg/L.In cellular assay，when the exposure concentration of MTBE was higher than 5.0 mmol/L，the proliferation of CHO cells was inhibited （P<0.05）.When the exposure concentration of MTBE was 50.0 mmol/L，SOD activity obviously increased （P< 0.05）.When the exposure concentration of MTBE was 25.0 mmol/L，CAT activity reached the maximum value，and it had significant differences with CK （P<0.05）.When the exposure concentration of MTBE was 25.0 mmol/L，GSHPx activity in CHO treatment group obviously increased （P<0.05）.[Conclusion] MTBE exposure can induce the toxicity to zebra fish and CHO cells，and the activity changes of oxidative stressrelated enzymes may one mechanism of MTBEinduced toxicity.

Key words Methyl tertbutyl ether；Zebra fish；Chinese hamster ovary cells；Toxicological effect；Oxidative stress

甲基叔丁基醚（Methyl tertbutyl ether，MTBE）作為汽油添加劑，可以增加汽油的辛烷值，提高汽油燃燒效率，減少一氧化碳和其他有害物質(zhì)（如臭氧、苯）的排放，降低空氣污染[1]。隨著MTBE的普遍推廣使用，對(duì)其毒理學(xué)研究也在不斷深入，研究表明MTBE對(duì)職業(yè)人群能產(chǎn)生一定的危害。隨著國(guó)內(nèi)各大城市機(jī)動(dòng)車數(shù)量的快速增長(zhǎng)，大量的汽車尾氣導(dǎo)致MTBE排放到大氣中，形成新的空氣污染問題。在珠江三角洲地區(qū)，大氣環(huán)境中已經(jīng)能夠普遍檢測(cè)出MTBE污染物[2]。MTBE有較強(qiáng)的水溶性，容易滲入土壤污染水體，嚴(yán)重威脅人們的飲用水源。開展MTBE的毒性效應(yīng)研究，對(duì)于建立全面的MTBE健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有十分重要的意義[3]。

斑馬魚具有與人類相似的各種器官系統(tǒng)，且斑馬魚基因與人類基因的相似度高達(dá)87%。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織于20世紀(jì)80年代推薦斑馬魚為毒性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)用魚， 目前斑馬魚已被作為健康毒性和環(huán)境毒性檢測(cè)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)魚類，受到生物學(xué)家的重視并被作為魚環(huán)境毒理學(xué)研究的模式生物[4]。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞是一類具有強(qiáng)大生命力、本身很少分泌內(nèi)源蛋白的細(xì)胞株，在生物工程、藥學(xué)及毒理學(xué)等體外研究中被廣泛使用[5]。目前，關(guān)于MTBE的毒性研究主要集中在雄性生殖細(xì)胞上[6]，在斑馬魚和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞上的相關(guān)報(bào)道很少。筆者研究了MTBE對(duì)斑馬魚的急性毒性及其對(duì)CHO細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用，旨在為MTBE的毒性評(píng)價(jià)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。斑馬魚由深圳大學(xué)提供，平均體長(zhǎng)（26.0±2.0） mm，平均體重（0.26±0.11）g；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)保藏中心）。

1.1.2 儀器與試劑。HF safe-1200 A2型生物安全柜，為上海力新儀器有限公司產(chǎn)品；3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱，為美國(guó)Thermo Forma公司產(chǎn)品；GS-15R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，為美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品；二甲基亞砜，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； 甲基叔丁基醚，購(gòu)自上海阿拉丁公司。RPMI-1640培養(yǎng)基粉、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胎牛血清（FBS），均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；總SOD活力檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化酶檢測(cè)試劑盒及細(xì)胞裂解液，均購(gòu)自上海碧云天生物公司；德國(guó)Eppendorf移液槍；5 L玻璃水槽。

1.2 方法

1.2.1 MTBE對(duì)斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)。采用半靜態(tài)試驗(yàn)法，設(shè)定甲基叔丁基醚濃度梯度分別為10、20、40、60、80、100 mg/L。在水槽中裝入4 L經(jīng)曝氣的自來(lái)水（去氯處理），pH為（7.5±0.5），水中溶氧量大于空氣飽和值的80%，水質(zhì)硬度為（205±13）mg/L（以CaCO3計(jì)），溫度為（27.0±1.0）℃。采用自然光與白熾燈光照明，每天喂食2次。每槽飼養(yǎng)斑馬魚10尾，設(shè)置6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和助溶劑對(duì)照組。試驗(yàn)期間不喂食，前8 h連續(xù)觀察，記錄魚的反應(yīng)情況，及時(shí)撈出死亡個(gè)體，此后48 h觀察并記錄魚的死亡情況。判斷魚的死亡標(biāo)準(zhǔn)：魚腹部向上，鰓蓋停止運(yùn)動(dòng)，用玻璃棒輕擊魚尾部，若魚體不產(chǎn)生任何反應(yīng)，判定為死亡。根據(jù)各組試驗(yàn)魚的48 h死亡率，計(jì)算平均死亡率，然后采用寇氏法計(jì)算MTBE對(duì)斑馬魚的48 h LC50，計(jì)算公式：

lgLC50=Xm-i（∑p-0.5）

式中，Xm為死亡組最大劑量的對(duì)數(shù)值；i為相鄰2組劑量對(duì)數(shù)值之差；p為各組某一時(shí)間點(diǎn)的死亡率；∑p為某一時(shí)間點(diǎn)的死亡率之和[7]。

1.2.2 MTBE對(duì)CHO細(xì)胞的毒性試驗(yàn)。將CHO細(xì)胞置于添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度80%時(shí)，于含濃度分別為0、0.5、5.0、25.0、50.0、100.0 mmol/L MTBE溶液的MEM培養(yǎng)基中進(jìn)行暴露，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，加入20 μL的MTT試劑，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，在490 nm波長(zhǎng)處使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（A）值，參比波長(zhǎng)為630 nm，計(jì)算細(xì)胞增殖存活率和半抑制濃度（IC50）。按照以下公式計(jì)算抑制率（IR）：

IR=[（空白對(duì)照組A值-處理組A值）/（空白對(duì)照組A值-本底組A值）]×100%

1.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活力的測(cè)定。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞置于含終濃度分別為0（對(duì)照）、0.5、5.0、25.0、50.0、100.0 mmol/L MTBE的MEM培養(yǎng)基中暴露12 h，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清液，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度；在560 nm處測(cè)定吸光度值，使用總SOD活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定SOD活力，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)反應(yīng)體系中的SOD活力單位定義為1個(gè)酶活力單位（U），用蛋白濃度校正，活力單位為U/mg prot表示。

1.2.4 過(guò)氧化氫酶（CAT）活力的測(cè)定。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞置于含終濃度分別為0（對(duì)照）、0.5、5.0、25.0、50.0、100.0 mmol/L MTBE的MEM培養(yǎng)基中暴露12 h，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清液，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，在520 nm處測(cè)定吸光度（A）值，使用CAT活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定CAT活力，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。CAT活力采用蛋白值校正，酶活力單位用U/mg prot表示。

1.2.5 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力的測(cè)定。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞置于含終濃度分別為0（對(duì)照）、0.5、5.0、25.0、50.0、100.0 mmol/L MTBE的MEM培養(yǎng)基中暴露12 h，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清液，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，使用GSH-Px活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定GSH-Px活力，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。GSH-Px活力采用蛋白值校正，酶活力單位用U/mg prot表示。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTBE對(duì)斑馬魚的毒性作用 斑馬魚在100 mg/L的MTBE溶液中飼養(yǎng)3 h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在80 mg/L的MTBE溶液中飼養(yǎng)6 h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在60 mg/L的MTBE溶液中飼養(yǎng)12 h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，斑馬魚初期表現(xiàn)為游動(dòng)能力下降，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)失去平衡，無(wú)運(yùn)動(dòng)能力的現(xiàn)象，最后躺臥死亡。斑馬魚在10～40 mg/L的MTBE、溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組的試驗(yàn)溶液中飼養(yǎng)48 h，未發(fā)現(xiàn)斑馬魚有任何毒性反應(yīng)。根據(jù)各組斑馬魚的死亡情況，計(jì)算各組死亡率。當(dāng)MTBE濃度為60 mg/L時(shí)，斑馬魚死亡數(shù)為2，死亡率20%；當(dāng)MTBE濃度為80 mg/L時(shí)，死亡率為60%；當(dāng)MTBE濃度為100 mg/L時(shí)，死亡率達(dá)到100%。采用寇氏法計(jì)算出MTBE對(duì)斑馬魚的48 h LC50為71.5 mg/L。

2.2 不同濃度MTBE對(duì)CHO細(xì)胞增殖水平的影響 從圖1可以看出，經(jīng)MTBE暴露處理12 h后，與對(duì)照組相比，當(dāng)MTBE暴露濃度高于5.0 mmol/L時(shí)，CHO細(xì)胞增殖水平受到抑制（P<0.05）。

2.3 不同濃度MTBE對(duì)CHO細(xì)胞SOD活力的影響 從圖2可以看出，經(jīng)MTBE暴露處理12 h后，CHO細(xì)胞的SOD活力隨MTBE濃度的升高而升高。當(dāng)MTBE濃度達(dá)到50.0 mmol/L時(shí)，CHO處理組SOD活力明顯上升，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。

2.4 不同濃度MTBE對(duì)CHO細(xì)胞CAT活力的影響 從圖3可以看出，MTBE對(duì)CHO細(xì)胞染毒12 h后，與對(duì)照組相比，各處理組CHO細(xì)胞的CAT活力出現(xiàn)不同程度升高。當(dāng)MTBE濃度達(dá)到25.0 mmol/L時(shí)，CAT活力達(dá)到最大值且與對(duì)照組差異顯著（P<0.05），但隨著MTBE濃度的繼續(xù)升高，CAT活力出現(xiàn)一定程度下降。

2.5 不同濃度MTBE對(duì)CHO細(xì)胞GSH-Px活力的影響 從圖4可以看出，經(jīng)MTBE暴露處理12 h后，CHO細(xì)胞的GSH-Px活力隨MTBE濃度的升高而升高，當(dāng)MTBE濃度達(dá)到25.0 mmol/L時(shí)，CHO處理組GSH-Px活力明顯上升，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

MTBE由異丁烯和甲醇化合而成，可以降低汽油的抗爆性、促進(jìn)汽油充分燃燒，是一種廣泛使用的汽油添加劑[8]。在汽油使用過(guò)程中，MTBE并不能被完全燃燒，會(huì)隨汽車尾氣排入周圍空氣中。隨著我國(guó)汽車保有量的不斷增加，汽油消耗量不斷增加，最終進(jìn)入環(huán)境中的 MTBE 越來(lái)越多。MTBE 易溶于水且較難降解，進(jìn)入地下水的 MTBE 對(duì)自然界造成了持續(xù)、廣泛的污染，可能對(duì)人類生活和健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[9-10]。近年來(lái)，斑馬魚作為模式動(dòng)物，在國(guó)內(nèi)水體污染監(jiān)測(cè)和控制等方面的應(yīng)用逐漸受到研究機(jī)構(gòu)的重視，很多國(guó)內(nèi)研究者開展了激素、中藥、有毒化學(xué)品等對(duì)斑馬魚的毒性研究[4]。筆者研究了不同濃度MTBE對(duì)斑馬魚的急性毒性作用，發(fā)現(xiàn)斑馬魚在100 mg/L MTBE溶液中飼養(yǎng)3 h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在80 mg/L MTBE試驗(yàn)溶液中飼養(yǎng)6 h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，在60 mg/L MTBE溶液中飼養(yǎng)12 h后開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)，斑馬魚在10～40 mg/L的MTBE、溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組的試驗(yàn)溶液中飼養(yǎng)48 h，未發(fā)現(xiàn)斑馬魚有任何毒性反應(yīng)。MTBE對(duì)斑馬魚的48 h LC50值為71.5 mg/L。該研究結(jié)果與Moreels等[11]研究結(jié)果相一致。

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種金屬酶，能催化ROS產(chǎn)生具有毒性的H2O2，再由CAT分解，2種酶聯(lián)合清除活性氧自由基，使機(jī)體免受氧化傷害，在正常的生理狀態(tài)下，由代謝活動(dòng)產(chǎn)生的活性氧可作為抗氧化防御體系。隨著MTBE濃度的升高，SOD活力逐漸升高。 Li等[6]將大鼠支持細(xì)胞暴露于MTBE，發(fā)現(xiàn)SOD活力顯著高于未經(jīng)MTBE暴露的細(xì)胞。這與該試驗(yàn)結(jié)果相一致，說(shuō)明在MTBE作用下機(jī)體受到脅迫，并誘導(dǎo)SOD活力升高，從而使生物體的生理機(jī)能免受損傷。過(guò)氧化氫酶（CAT）是一種廣泛存在于各類生物體中的酶抗氧化劑，清除體內(nèi)多余的H2O2，并具有很高的催化效率，從而使細(xì)胞免于遭受毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。隨著MTBE濃度的升高，CAT活力逐漸升高，說(shuō)明MTBE可使CHO細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫，并且CHO細(xì)胞受到脅迫后通過(guò)提高過(guò)氧化氫酶活力來(lái)抵御脅迫。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）作為一種重要的過(guò)氧化物分解酶，廣泛存在于機(jī)體中。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶一方面作為分解酶，能夠促進(jìn)H2O2的分解，另一方面能夠?qū)⒂卸镜倪^(guò)氧化物還原成無(wú)害的羥基化合物，保護(hù)細(xì)胞膜。一旦機(jī)體處于病理狀態(tài)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力水平就會(huì)偏離正常范圍。因此，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活力的改變可以間接了解細(xì)胞的損傷情況。MTBE暴露處理可以誘導(dǎo)CHO細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活力水平升高，說(shuō)明細(xì)胞可能通過(guò)提高GSH-Px活力來(lái)進(jìn)行抵御MTBE誘發(fā)的細(xì)胞毒性。

綜上所述，MTBE暴露對(duì)斑馬魚和CHO細(xì)胞具有明顯的毒性作用，且可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激相關(guān)的酶活力水平提高，說(shuō)明氧化應(yīng)激效應(yīng)可能是MTBE毒性作用之一。

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