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    單核細胞增生李斯特氏菌生物膜形成特性

    2017-07-13 05:25陳康勇彭芳薛竣仁鐘為銘高志鵬
    安徽農(nóng)業(yè)科學 2017年24期
    關(guān)鍵詞:生物膜

    陳康勇 彭芳 薛竣仁 鐘為銘 高志鵬

    摘要 [目的]研究單增李斯特氏菌生物膜的形成特性。[方法]采用24孔板法培養(yǎng)生物膜,分別采用結(jié)晶紫染色法和光學顯微鏡進行生物膜的定量和定性研究,觀察在不同培養(yǎng)時間(8、16、24、32、40、48 h)單增李斯特氏菌生物膜的形成狀況。[結(jié)果]隨著培養(yǎng)時間的增加,單增李斯特氏菌生物膜生物量逐漸增加,生物膜經(jīng)歷了黏附、微菌落形成、大菌落形成到成熟的全部過程。[結(jié)論]試驗結(jié)果為單增李斯特氏菌生物膜相關(guān)研究提供了理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞 單核細胞增生李斯特氏菌;生物膜;形成特性

    Biofilm Formation Characteristics of Listeria monocytogenes

    CHEN Kang-yong1,PENG Fang1,XUE Jun-ren1,GAO Zhi-peng1,2* et al (1.College of Animal Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128; 2.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province,Changde,Hunan 415000)

    Abstract [Objective]The aim was to investigate the biofilm formation characteristics of Listeria monocytogenes. [Method]To investigate the characteristics of Listeria monocytogenes biofilm at different incubation times (8,16,24,32,40,48 h),24-well plate method was used to cultivate biofilm,and quantitative and qualitative data were obtained by crystal violet staining assay and light microscopy.[Result]With the increase of culture time,the biomass of Listeria monocytogenes biofilm increased gradually,and the biofilm went through the process of adhesion,microcolony formation,macrocolony formation to mature.[Conclusion]The results provide a theoretical basis for the related research of Listeria monocytogenes biofilm.

    Key words Listeria monocytogenes;Biofilm;Formation characteristics

    生物膜(BF)是細菌為了適應生存環(huán)境,黏附于非生物或者活性組織的表面,包被于自身分泌的胞外基質(zhì)中,形成的一種三維聚合網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),細菌生物膜是一種和浮游生長對應的生長方式[1-3]。生物膜參與65%以上的感染,尤其是與醫(yī)療器械相關(guān)的、機體表面的(如皮膚、軟組織等)和慢性感染,原因主要是生物膜對宿主防御和抗菌藥物具有很強的抵御能力[4-6]。生物膜是細菌耐藥性產(chǎn)生的重要原因,可使細菌的耐藥性提高10~1 000倍[7-8]。生物膜感染已成為全球關(guān)注的問題。

    單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是一種能在冷藏的溫度下進行繁殖的致病菌,由于該細胞的苯酚-水浸出物能夠誘導單核細胞生成,所以被命名為“單核增生細菌”[9]。人或者牲畜感染之后主要表現(xiàn)出敗血癥、胃腸炎、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等癥狀[10]。嬰幼兒、老年人以及免耐受病人的臨床死亡率約為30%[11]。該菌種在自然界廣泛存在,對于不利的生長環(huán)境條件具有很強的耐受能力,在4 ℃冰箱中可生長繁殖,所以各類冷凍食品均成為被感染對象,如肉制品、奶制品、冰激凌等[12]。在對含有單增李斯特氏菌的乳制品進行超高壓處理研究中發(fā)現(xiàn),在500 MPa、10 min、20 ℃下處理乳制品,雖然能夠降低其單增李斯特氏菌活菌量,但仍有細菌存活并繁殖[13]。同時,單增李斯特氏菌對水產(chǎn)品也具有較高的污染程度[14-15]。單增李斯特氏菌所產(chǎn)生的生物膜可保護其不受抗菌藥物作用,并且能降低機體免疫細胞的吞噬作用。試驗表明,在任何溫度條件下,單增李斯特氏菌可在固體表面形成生物膜,并且能夠在很長時間黏附于固體表面,其生物膜的形成引起了食品、用品衛(wèi)生安全的隱患[16]。

    單增李斯特氏菌生物膜所導致的相關(guān)性疾病患病率逐年上升,至今很少有藥物能有效控制該類感染,深入研究單增李斯特氏菌生物膜形成特性,對于尋找有效的防治藥物和方法具有重要意義。筆者研究了單增李斯特氏菌生物膜的形成過程,以期為單增李斯特氏菌研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試菌。單核細胞增生李斯特氏菌(編號:ATCC19115),購自廣東省微生物研究所。

    1.1.2 主要試劑。LB肉湯(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、技術(shù)瓊脂粉(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、0.1%結(jié)晶紫溶液(Sigma公司)、95%乙醇溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)和4%多聚甲醛(Sigma公司)。

    1.1.3 主要儀器。

    熒光多功能酶標儀、光學顯微鏡、24孔和96孔細胞培養(yǎng)板、高壓滅菌鍋和高速彩色平臺掃描儀。

    1.2 方法

    1.2.1 單增李斯特氏菌生物膜培養(yǎng)。

    采用24孔板法,具體操作:取單個單增李斯特氏菌菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。取10 μL 菌液轉(zhuǎn)接至預先加入無菌蓋玻片(12 mm)和2 mL 新鮮LB培養(yǎng)液的24孔細胞培養(yǎng)板中,然后37 ℃靜置培養(yǎng)。

    1.2.2 不同培養(yǎng)時間對單增李斯特氏菌生物膜形成特性的影響。

    按培養(yǎng)時間分別設(shè)置8、16、24、32、40、48 h 6個試驗組,每組分別做6個平行,按照“1.2.1”進行生物膜培養(yǎng),在上述時間點進行結(jié)晶紫染色試驗和顯微鏡觀察。

    1.2.3 單增李斯特氏菌生物膜結(jié)晶紫染色試驗。

    利用生物膜內(nèi)物質(zhì)可與特殊染料結(jié)合的原理,通過染色的方法對生物膜進行定性或定量分析。單增李斯特氏菌生物膜形成后,將24孔板從培養(yǎng)箱中取出,吸出培養(yǎng)液,用無菌PBS浸洗蓋玻片3次,然后用4%多聚甲醛固定20 min,棄固定液,并用無菌PBS浸洗3次,洗去浮游菌,使黏附在蓋玻片的生物膜自然風干,室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,吸除染色液后,用無菌PBS浸洗3次,自然風干,然后用高速彩色平臺掃描儀掃描拍照。

    1.2.4 單增李斯特氏菌生物膜生物量的測定。

    單增李斯特氏菌生物膜形成后,吸出培養(yǎng)液,用無菌PBS浸洗蓋玻片3次,每孔加入200 μL 95%乙醇,置于搖床30 min使結(jié)晶紫完全溶解,溶解液轉(zhuǎn)移至96孔細胞培養(yǎng)板中,并用酶標儀測定540 nm波長處的吸光度,即OD540,每個試驗重復3次。

    1.2.5 顯微鏡觀察單增李斯特氏菌生物膜。

    方法同“1.2.3”,結(jié)晶紫染色后,用無菌PBS浸洗蓋玻片3次,然后置于100倍油鏡下觀察生物膜的形成狀況,并拍照記錄。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同培養(yǎng)時間下單增李斯特氏菌生物膜結(jié)晶紫染色結(jié)果

    研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特氏菌生物膜的形成分為4個階段,即黏附階段、微菌落形成階段、大菌落形成階段和成熟階段。①黏附階段(0~16 h):細菌逐漸聚集并黏附于介質(zhì)(蓋玻片)表面,生物膜形成速度較慢;②微菌落形成階段(17~24 h):生物膜結(jié)晶紫染色較淺,微菌落開始形成,并呈斑塊狀分布;③大菌落形成階段(25~32 h):細菌聚集明顯,生物膜斑塊變大,32 h時布滿蓋玻片,結(jié)晶紫染色加深;④成熟階段(33~48 h):結(jié)晶紫染色比前32 h明顯加深,生物膜斑塊更加密集,厚度增大,40 h時生物膜基本形成,33~48 h形成的生物膜的OD540快速增長。隨著培養(yǎng)時間的增加,單增李斯特氏菌的生物膜呈現(xiàn)出從黏附聚集到成熟的過程,于48 h達到最成熟的狀態(tài)(圖1、2)。

    2.2 不同培養(yǎng)時間下單增李斯特氏菌生物膜顯微觀察結(jié)果

    ①黏附階段:在物鏡為100倍的顯微鏡下可觀察到生物膜的厚度小,菌落間的通道多,說明生物膜形成并不成熟。②微菌落形成階段:微菌落開始形成,生物膜斑塊數(shù)量增多,生物膜的厚度開始增加,菌落間通道變少。③大菌落形成階段:結(jié)晶紫染色變深,開始形成較為致密的生物膜,但生物膜斑塊比較分散,菌落間通道繼續(xù)變少。④成熟階段:生物膜斑塊大量增加并且形成了牢固、穩(wěn)定的網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu),生物膜厚度明顯增加,染色顯著加深,培養(yǎng)至48 h時生物膜極厚,菌落之間幾乎沒有通道,生物膜完全成熟(圖3)??梢?,生物膜形成期間,菌落間的通道不斷減少,生物膜斑塊逐漸增加并且密集,生物膜的厚度逐漸增加,并趨于成熟。

    3 討論

    細菌生物膜的形成是一個動態(tài)過程,隨著細菌的生長,生物膜對營養(yǎng)因子的通透性變差,同時細菌也開始老化甚至失去了成膜能力。進入成熟期后,隨著生存環(huán)境中營養(yǎng)等限制因子的消耗以及代謝產(chǎn)物的積累,細菌的生長開始受到限制,生物膜的形成達到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài),此時生物膜的厚度基本穩(wěn)定。進入衰老期后,伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗,生物膜中細菌的大部分蛋白質(zhì)和RNA的合成速率降低,致使胞外多糖的合成量減少,生物膜的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)崩解甚至細菌也開始從生物膜表面脫落,再次成為游離菌,使生物膜的厚度減少。

    單增李斯特氏菌生物膜的形成是一個復雜的過程,涉及到多種蛋白、核酸分子和多糖等因素,同時也受到各種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的共同作用。深入研究單增李斯特氏菌生物膜的形成和調(diào)控的分子機制對尋找特異性干預靶點具有重要意義。該試驗目前只是研究培養(yǎng)時間對單增李斯特氏菌生物膜形成的影響,主要是通過觀察細菌生物膜的形成情況來說明培養(yǎng)時間對生物膜的影響,后續(xù)試驗還可研究環(huán)境因素對單增李斯特氏菌生物膜基質(zhì)組成的影響,通過觀察環(huán)境因素對生物膜中蛋白質(zhì)、胞外多糖、胞外DNA組成的影響,進一步探究單增李斯特氏菌生物膜的形成機制。

    4 結(jié)論

    采用24孔板法和結(jié)晶紫染色法研究單增李斯特氏菌生物膜的形成過程,發(fā)現(xiàn)在靜置培養(yǎng)條件下的單增李斯特氏菌生物膜的形成經(jīng)歷了4個階段,0~16 h為細菌黏附階段,17~24 h為微菌落形成階段,25~32 h為大菌落形成階段,33~48 h為成熟階段。細菌黏附階段,菌落間的通道多,形成生物膜速度慢。微菌落形成階段,隨著培養(yǎng)時間的延長,生物膜結(jié)晶紫染色顏色變深,細菌開始形成微菌落,但形成速度較慢,并開始形成生物膜斑塊。大菌落形成階段,細菌形成的大量微菌落聚集成大菌落,生物膜斑塊增大,開始形成較為致密的生物膜,結(jié)晶紫染色快速變深。成熟階段,生物膜斑塊快速增大并且密集,形成了具有牢固、穩(wěn)定的網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)的生物膜,菌落間的通道不斷減少。培養(yǎng)48 h期間,單增李斯特氏菌生物膜的生物量隨培養(yǎng)時間的增加而增大,表明細菌生物膜的生長經(jīng)歷了從黏附聚集到成熟的過程,在48 h生物膜生長達到完全成熟的狀態(tài)。

    參考文獻

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