胞核內(nèi)高表達(dá)M—CSF對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

李旎　詹向陽(yáng)　陳艷華

[摘要] 目的 分析人宮頸癌HeLa細(xì)胞核內(nèi)M-CSF增高對(duì)化療藥物的影響。 方法 體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞、HeLa-M細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染M-CSF空載體HeLa-C細(xì)胞。分別使用紫杉醇和順鉑（濃度分別為0.3、3、30 μg/mL）作用48 h，采用MTT方法比較細(xì)胞的相對(duì)活性，Westen blot分析轉(zhuǎn)染M-CSF對(duì)抗凋亡分子Bcl-2表達(dá)的影響。 結(jié)果 當(dāng)兩種化療藥物的濃度為3、30 μg/mL時(shí)，與HeLa-C細(xì)胞和HeLa細(xì)胞相比，HeLa-M細(xì)胞活性明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；當(dāng)濃度為0.3 μg/mL時(shí)三種細(xì)胞活性無(wú)明顯差異。Westen blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染M-CSF后能夠使細(xì)胞中的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平明顯升高。 結(jié)論 人宮頸癌HeLa細(xì)胞核中的M-CSF增高可以使細(xì)胞的藥抗性提高，從而抑制HeLa細(xì)胞的凋亡。

[關(guān)鍵詞] 人宮頸癌；HeLa細(xì)胞核；M-CSF；化療藥物

[中圖分類號(hào)] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）16-0030-03

[Abstract] Objective To analyze the effect of elevated M-CSF in nuclei on the chemotherapeutic drugs of human cervical cancer HeLa cells. Methods HeLa cells， HeLa-M cells and HeLa-C transfected with M-CSF empty vector were cultured in vitro. The paclitaxel and cisplatin（concentrations were 0.3， 3， 30 μg/mL） were used for 48 h， respectively. The relative viability of the cells was compared by MTT method. The effect of transfection with M-CSF on the expression of Bcl-2 was detected by Western blot analysis. The effect of paclitaxel and cisplatin （concentration 0.3， 3， 30 μg/mL） on the expression of anti-apoptotic molecule Bcl-2 was detected by MTT method. Results The viability of HeLa-M cells was significantly higher than that of HeLa-C cells and HeLa cells when the concentration of the two chemotherapeutic drugs was 3， 30 μg/mL， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no significant difference in cell viability between the three kinds of cells when the concentration was 0.3 μg/mL. The results of Western blot showed that the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was significantly increased after transfection with M-CSF. Conclusion The increase of M-CSF in the nucleus of human cervical cancer HeLa cells can improve the drug resistance of the cells and inhibit the apoptosis of HeLa cells.

[Key words] Human cervical cancer； HeLa nucleus； M-CSF； Chemotherapy drugs

M-CSF即巨噬細(xì)胞集落刺激因子，簡(jiǎn)稱集落刺激因子[1]，主要是由鏈間二硫鍵所形成的同源二聚體糖蛋白，其與CSF-1R相互作用會(huì)使受體發(fā)生二聚化反應(yīng)，隨后可以與細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)通路發(fā)生相應(yīng)的作用，比如JAK/STAT等，與不同細(xì)胞作用會(huì)產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)[2-3]。2006年時(shí)相關(guān)學(xué)者以小鼠為例，使用抗M-CSF逆轉(zhuǎn)了種植在小鼠身上的MCF-7細(xì)胞，這說(shuō)明在治療乳腺癌中，抗M-CSF是一種潛在的治療方法[4]。對(duì)婦女而言，宮頸癌是第二種常見(jiàn)的惡性腫瘤疾病，臨床上的常見(jiàn)藥物為順鉑類藥物，但是容易產(chǎn)生耐藥性[5-6]。因此，對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞核內(nèi)的M-CSF研究具有深遠(yuǎn)的意義。本研究對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從北京醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù)中購(gòu)入人宮頸癌HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的HeLa-C細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染M-CSF細(xì)胞等需要在前期通過(guò)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染得到。所使用的MTT從Sigama公司購(gòu)買。順鉑從哈爾濱三聯(lián)制藥公司購(gòu)入，紫杉醇為齊魯制藥公司生產(chǎn)。DMSO由美國(guó)Ameresco公司生產(chǎn)，低溫高速離心機(jī)從德國(guó)引入，生化培養(yǎng)箱為SANYO公司生產(chǎn)，其他試劑為我國(guó)國(guó)內(nèi)生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞 所用細(xì)胞分別在DEME培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中含有10%小牛血清，將其放置在常溫37℃環(huán)境下、5%濃度CO2培養(yǎng)箱中，實(shí)驗(yàn)周期選擇細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。當(dāng)前臨床上治療宮頸癌的主要藥物為紫杉醇和順鉑，具體的濃度按照臨床常規(guī)劑量進(jìn)行配制。分別取高10倍和低10倍濃度作為比較濃度。

1.2.2 分組方法 順鉑治療情況下的三種細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，紫杉醇不同濃度情況下的三種細(xì)胞變化情況為對(duì)照組。

1.2.3 MTT檢測(cè)方法 首先，需要配制溶液，將0.5 g的MTT溶于磷酸緩沖液培養(yǎng)基中，容量為100 mL，細(xì)菌的去除使用0.22 μm濾膜過(guò)濾，置4℃環(huán)境下避光保存，配制和保存時(shí)都需要使用鋁箔紙來(lái)避光。其次，檢測(cè)細(xì)胞成長(zhǎng)方法，對(duì)完全培養(yǎng)基的細(xì)胞濃度進(jìn)行調(diào)整，濃度為5×103個(gè)/mL，每孔接入96孔培養(yǎng)板，再分別加入順鉑和紫杉醇，每組3孔，持續(xù)48 h。再加入100 μL/孔的DMSO，振搖均勻之后使用EXL-800型酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.2.4 Western blot測(cè)定方法 在細(xì)胞生長(zhǎng)到90%左右時(shí)，需要使用冰預(yù)冷的PBS清洗2次。1000 rpm，時(shí)間為5 min，去除上清，再加入細(xì)胞裂解液，劑量為70 μL，沉淀，置冰上30 min，在4℃的環(huán)境下進(jìn)行離心，10 min后收集上清。最后加入蛋白上樣緩沖液，在100℃的環(huán)境下煮沸，時(shí)間持續(xù)5 min，在-20℃溫度中保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次研究所選用的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS 19.7，對(duì)研究中涉及的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度化療藥物對(duì)M-CSF活性影響比較

共進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。當(dāng)藥物濃度在3 μg/mL時(shí)，HeLa-M細(xì)胞核與HeLa細(xì)胞和HeLa-C細(xì)胞相比，細(xì)胞活性差異顯著（P<0.05）；當(dāng)藥物濃度在30 μg/mL時(shí)，HeLa-M細(xì)胞核與HeLa細(xì)胞和HeLa-C細(xì)胞相比，細(xì)胞活性差異顯著（P<0.05）；而藥物濃度在0.3 μg/mL，三種細(xì)胞活性無(wú)顯著差異（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 Westen blot方法檢測(cè)結(jié)果分析

結(jié)果顯示，與HeLa細(xì)胞和HeLa-C細(xì)胞相比，HeLa-M細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)明顯偏高（HeLa、HeLa-C、HeLa-M灰度值分別為0.08±0.04、0.06±0.02、0.34±0.07）。而HeLa和HeLa-C細(xì)胞之間無(wú)明顯差異，見(jiàn)封三圖1。

3討論

宮頸癌和乳腺癌均是比較常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，對(duì)婦女的健康產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅[7]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，在包含宮頸癌和乳腺癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤中巨噬細(xì)胞集落刺激因子水平會(huì)出現(xiàn)異常升高的現(xiàn)象，但是在其相應(yīng)的良性腫瘤中卻不容易被發(fā)現(xiàn)或處于正?，F(xiàn)象，提示在血清的循環(huán)中，M-CSF很可能會(huì)成為這些腫瘤的分子標(biāo)記物，與這些惡性腫瘤的發(fā)生存在密切的關(guān)系[8-10]。M-CSF簡(jiǎn)稱為集落刺激因子，主要是由細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中多種細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子，此種細(xì)胞因子具有特異性[11]。根據(jù)相關(guān)研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子可能在許多腫瘤如宮頸癌等發(fā)生中扮演著十分重要的角色[12]。

M-CSF所發(fā)揮的作用十分重要，不管是正常情況還是腫瘤發(fā)生時(shí)，根據(jù)相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示在不少惡性腫瘤中通常會(huì)出現(xiàn)M-CSF水平異常增高的現(xiàn)象，但是在良性腫瘤或者交界性腫瘤中卻很難檢測(cè)到[13]。近幾年的研究更是表明M-CSF與惡性腫瘤的預(yù)后有著密切聯(lián)系，有學(xué)者提出可以將M-CSF作為一些惡性腫瘤的標(biāo)記物。在治療腫瘤的過(guò)程中不少化療藥物均是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡對(duì)細(xì)胞殺傷而實(shí)現(xiàn)治療腫瘤的目的[14-15]。由于腫瘤耐藥的靶分子、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因可以與多藥耐藥其他途徑一起介導(dǎo)多藥耐藥。

為了明確HeLa細(xì)胞核內(nèi)M-CSF對(duì)化療藥物所產(chǎn)生的影響以及相關(guān)的作用機(jī)制，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在治療劑量以及高于治療劑量的情況下，人宮頸癌HeLa細(xì)胞核內(nèi)的M-CSF細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比，對(duì)紫杉醇和順鉑的敏感性更低，對(duì)化療藥物的敏感性降低將會(huì)導(dǎo)致患者在臨床治療過(guò)程中出現(xiàn)耐藥。本次研究分別以不同的化療藥物濃度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)藥物濃度在0.3 μg/mL時(shí)，各種細(xì)胞的活性最高，但細(xì)胞之間的活性無(wú)明顯差異。另外，HeLa-M細(xì)胞的Bcl-2活性更高，Bcl-2是移植細(xì)胞凋亡增加耐藥性的重要分子機(jī)制。細(xì)胞對(duì)于凋亡抑制作用的增強(qiáng)很可能與抗凋亡基因自身的變化密切相關(guān)，比如其出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)或突變、缺乏等現(xiàn)象。與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因包含Bcl-2和Bcl-x1等。前者過(guò)度表達(dá)將會(huì)使腫瘤細(xì)胞凋亡得到有效抑制，對(duì)化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的效果產(chǎn)生一定影響。Bcl-2家族是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因家族，為同一個(gè)同源蛋白家族。當(dāng)前越來(lái)越多的學(xué)者研究證實(shí)，Bcl-2可以使化療的耐受性得到提高，還可提高腫瘤惡變的潛力和復(fù)發(fā)率。

綜上所述，人宮頸癌HeLa細(xì)胞核中的M-CSF增高可以使細(xì)胞的藥抗性提高，對(duì)HeLa細(xì)胞的消亡起到抑制作用。

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（收稿日期：2017-04-09）