丹皮酚與鈣粘素相互作用的分析研究

許鳳杰++彪林海++祖元剛++劉志國

摘要丹皮酚對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，而鈣粘素是與腫瘤產(chǎn)生和惡化密切相關(guān)的一類糖蛋白。本研究運(yùn)用熒光光譜法和原子力顯微技術(shù)探索了丹皮酚與鈣粘素的相互作用。熒光光譜法研究結(jié)果表明，丹皮酚對鈣粘素的熒光具有顯著的猝滅作用，通過猝滅常數(shù)隨溫度變化趨勢推斷為靜態(tài)猝滅過程。丹皮酚與鈣粘素形成復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)分別為ΔH=

Symbolm@@ 4.3×105 J/mol和ΔS=-1.3×103 J/（mol·K）， 表明此結(jié)合過程以氫鍵和范德華力為主。原子力顯微觀察結(jié)果表明，鈣粘素分子間可形成有序長鏈結(jié)構(gòu)，丹皮酚加入后能顯著破壞這種組裝結(jié)構(gòu)而形成短鏈結(jié)構(gòu)，這是由于丹皮酚與鈣粘素末端色氨酸殘基的作用而影響相鄰鈣粘素分子結(jié)構(gòu)域間的交錯作用所致。本研究結(jié)果表明，鈣粘素可能是丹皮酚體現(xiàn)其活性的一個重要作用靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞丹皮酚； 鈣粘素； 熒光光譜法； 原子力顯微鏡

1引 言

丹皮酚（Paeonol）是在傳統(tǒng)中藥牡丹皮中提取出的一種小分子酚類化合物。近來的研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚具有抗腫瘤作用＼[1＼]。藥理活性實(shí)驗(yàn)顯示，丹皮酚對食道癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用＼[2～4＼]。深入探索丹皮酚在體內(nèi)的各種可能的作用靶點(diǎn)及它們之間的作用機(jī)制，可為進(jìn)一步開發(fā)丹皮酚及其衍生物作為抗癌藥物提供科學(xué)依據(jù)。

中藥小分子可與人體內(nèi)的蛋白發(fā)生相互作用，從而決定其藥理活性作用＼[5＼]。研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚和阿魏酸在生理?xiàng)l件下均能與人血清白蛋白（HSA）發(fā)生相互作用，并且它們之間會競爭HSA上的同一位點(diǎn)。因此，中醫(yī)用藥常將含有丹皮酚與阿魏酸的中藥配伍使用來提高療效。丹皮酚在體內(nèi)還可能與其它蛋白產(chǎn)生相互作用，進(jìn)而影響其藥理活性。

鈣粘素（Cadherin）是在細(xì)胞與細(xì)胞粘附過程中發(fā)揮重要作用的一類鈣離子依賴型粘附蛋白＼[6＼]。Pary ＼[7＼]和AnneKarina ＼[8＼]等的研究都證實(shí)了E鈣粘素與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有重要聯(lián)系。最近的研究表明，血清中E鈣粘素的濃度增高與腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)＼[9～12＼]。胃腸癌患者血清中可溶性鈣粘素的濃度顯著高于健康對照組，這可能是由于腫瘤細(xì)胞表面的E鈣粘蛋白降解并釋放到血液中的緣故。因而，血清中可溶性鈣粘素的濃度可作為預(yù)防、診斷和治療胃腸癌的一個重要指標(biāo)＼[10，11＼]。

丹皮酚在血液中可與人血清白蛋白發(fā)生相互作用。最近的研究證實(shí)了丹皮酚可與人血清白蛋白以疏水作用形成復(fù)合物＼[13＼]。胃癌患者血清中可溶性鈣粘素的濃度平均水平（9344 ng/mL）顯著高于健康對照組（5616 ng/mL），并與腫瘤大小呈正相關(guān)＼[11＼]。因而，在胃癌患者的血清中，丹皮酚將有更多的機(jī)會與鈣粘素發(fā)生相互作用。本研究采用熒光光譜法和原子力顯微技術(shù)，分析了丹皮酚與鈣粘素的相互作用過程。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

F7000熒光光譜儀（日本日立公司）； NanoPhotometer N60型超微量分光光度計（德國IMPLEN公司）； PicoplusⅡ型原子力顯微鏡系統(tǒng)（美國Molecular Imaging公司）。

丹皮酚（純度≥99%， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 鈣粘素（ECadherin human， recombinant純度≥90%）和人血清白蛋白（HSA）， 購自于西格瑪奧德里奇（上海）有限公司； 鈣粘素原始濃度為0.5 mg/mL。 高定向熱解石墨片（HOPG， 愛沙尼亞Mikro Masch公司）。實(shí)驗(yàn)用水由MilliQ系統(tǒng)（電阻率>18 MΩ cm）純化制得。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1熒光光譜測定使用甲醇溶解丹皮酚，配制1 mmol/L溶液，然后用超純水逐步稀釋該溶液， 制得1 μmol/L丹皮酚溶液。用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.4）稀釋鈣粘素原始溶液，配制0.2 μmol/L鈣粘素溶液，用于光譜測定。在室溫和37℃條件下，依次向0.2 μmol/L鈣粘素溶液中滴入不同體積1 μmol/L

丹皮酚溶液，混合液在恒溫水浴保持5 min后，以280 nm為激發(fā)波長，在290～500 nm范圍內(nèi)記錄熒光光譜圖。

2.2.2原子力顯微鏡（AFM）觀察樣品的制備和表征采用磷酸鹽緩沖液將不同溫度條件下0.2 μmol/L鈣粘素與1 μmol/L丹皮酚相互作用的溶液，稀釋10倍，用于制作原子力顯微鏡觀察樣品。采用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH=7.4）稀釋鈣粘素原始溶液，配制0.02 μmol/L溶液，用于觀察單獨(dú)鈣粘素結(jié)構(gòu)。制作原子力顯微鏡觀察樣品時，分別取50 μL待觀察溶液，滴加于新制備的高定向熱解石墨片（HOPG）上，靜置吸附10 min后，除去液滴，用超純水沖洗10次以上，用以去除吸附不牢固的蛋白，最后用氬氣吹干。在使用原子力顯微鏡觀察前，將樣品放在干燥器中保存。

在氣相室溫條件下，原子力顯微鏡采用輕敲模式進(jìn)行成像。成像時使用NSC35探針（Mikromasch），針尖曲率半徑<10 nm，力常數(shù)7.5 N/m，掃描速度<1 lines/s，成像的共振頻率為130 kHz，所得原子力顯微圖像分辨率均為512 × 512。

3結(jié)果與討論

3.1丹皮酚與鈣粘素相互作用的紫外光譜法和熒光光譜法研究

圖1A為丹皮酚、鈣粘素以及兩者相互作用后溶液的紫外光譜吸收圖。丹皮酚在275和312 nm處有較強(qiáng)的吸收峰，此結(jié)果與文獻(xiàn)＼[14＼]一致。鈣粘素在280 nm有較強(qiáng)吸收峰。兩者相互作用后，溶液的紫外吸收圖譜與丹皮酚的圖譜極為相似，由于吸收圖譜相互疊加，所以吸收強(qiáng)度略有增高。

在紫外吸收測定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在室溫和37 ℃條件下分別測定了丹皮酚對鈣粘素?zé)晒夤庾V的影響。鈣粘素在280 nm激發(fā)后， 在337 nm處出現(xiàn)最大熒光發(fā)射峰見圖1B中a曲線，而丹皮酚在此波段沒有明顯的熒光。逐漸加入丹皮酚， 最大熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度逐步下降，如圖1B中b～k所示。此外，鈣粘素最大熒光發(fā)射波長從337 nm藍(lán)移至了335 nm。發(fā)射波長的藍(lán)移表明鈣粘素分子中色氨酸殘基的周圍環(huán)境發(fā)生了變化。加入丹皮酚可能使色氨酸殘基的吲哚基團(tuán)重新排列至一個更加疏水的微環(huán)境＼[15＼]。熒光猝滅數(shù)據(jù)可由SternVolmer方程進(jìn)行分析＼[16＼]：

式中， F0和F分別為無猝滅劑和有猝滅劑時鈣粘素的熒光強(qiáng)度， ＼[Q＼]為猝滅劑的濃度， KSV為猝滅常數(shù)， Kq是猝滅速率常數(shù)。 τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命， 生物大分子熒光壽命約為10

Symbolm@@ 8 s。

在不同溫度條件下計算得到的猝滅常數(shù)KSV見表1， KSV隨溫度升高而降低， 表明丹皮酚對鈣粘素的猝滅可能是靜態(tài)猝滅＼[16＼]。另外，由KSV可粗略推算出Kq值，遠(yuǎn)大于猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0 ×1010 L/（mol·s）＼[16＼]，進(jìn)一步表明丹皮酚與鈣粘素的作用屬于靜態(tài)猝滅， 它們之間可形成了復(fù)合物。

丹皮酚與鈣粘素的結(jié)合常數(shù)（Kb）及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）可由靜態(tài)猝滅方程進(jìn)行分析＼[17＼]。

式中， F0和F分別是鈣粘素與丹皮酚結(jié)合前和結(jié)合后的熒光強(qiáng)度。lg（（F0-F）/F）對lg＼[Q＼]作圖， 所得直線的斜率為n， 與Y軸截距為lgK。不同溫度時所得的K和n值列于表1。由表1可知， K值隨溫度升高而顯著減小， 表明鈣粘素與丹皮酚復(fù)合物的穩(wěn)定性逐漸減弱。室溫時n≈1，表明丹皮酚在鈣粘素上有一個結(jié)合位點(diǎn)。

Concentration of paeonol （a-k） is 0， 0.0024， 0.0048， 0.0072， 0.0096， 0.012，0.014， 0.016， 0.019， 0.021 and 0.023 μmol/L， respectively. T=298 K.

在相同條件下，考察了丹皮酚與人血清白蛋白的相互作用。丹皮酚對人血清白蛋白的熒光猝滅圖見圖1C。通過對猝滅常數(shù)的計算推測丹皮酚對人血清白蛋白猝滅也為靜態(tài)猝滅.計算所得猝滅常數(shù)（Ksv）、結(jié)合常數(shù)（K）及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）數(shù)值見表1。結(jié)果表明，丹皮酚也可與人血清白蛋白形成復(fù)合物。由表1的結(jié)合常數(shù)值可知，在室溫和37℃度條件下，丹皮酚與鈣粘素的結(jié)合常數(shù)值均大于它與人血清白蛋白的值，這表明丹皮酚與鈣粘素具有更強(qiáng)的相互作用。

3.2丹皮酚與鈣粘素結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)函數(shù)

當(dāng)體系中溫度變化較小時，結(jié)合反應(yīng)的焓變ΔH可認(rèn)為是常數(shù)。熱力學(xué)參數(shù)焓變ΔH、熵變ΔS及自由能變化ΔG可由Van′t Hoff 方程及自由能公式確定，計算所得ΔH、ΔS和ΔG值列于表 1。

ΔG<0，表明丹皮酚與鈣粘素的結(jié)合是自發(fā)進(jìn)行的。ΔH<0，表明形成復(fù)合物的過程是放熱過程。小分子與蛋白相互作用的熱力學(xué)函數(shù)可用于判斷它們之間作用力的類型。依據(jù)Ross 等關(guān)于小分子與蛋白結(jié)合過程中熱力學(xué)數(shù)據(jù)與各種作用力的關(guān)系研究＼[18＼]，ΔH<0和ΔS<0， 表明結(jié)合過程以氫鍵和范德華力為主。

丹皮酚與人血清白蛋白結(jié)合的熱力學(xué)函數(shù)也列入了表1中，依據(jù)ΔG、ΔH、ΔS值的大小，可推斷丹皮酚與人血清白蛋白的結(jié)合也是自發(fā)進(jìn)行的。丹皮酚與鈣粘素的結(jié)合過程中ΔH值遠(yuǎn)大于它與人血清白蛋白的ΔH，說明丹皮酚與鈣粘素能形成更穩(wěn)定的復(fù)合物。Wang＼[13＼]研究表明，丹皮酚與人血清白蛋白主要通過疏水相互作用，形成復(fù)合物，導(dǎo)致人血清白蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)都發(fā)生改變。本研究表明丹皮酚與鈣粘素的作用以氫鍵和范德華力為主。所以，丹皮酚與人血清白蛋白和鈣粘素的作用方式不同，使得它與兩種蛋白的結(jié)合能力有差別。

3.3原子力顯微鏡（AFM）成像結(jié)果分析

運(yùn)用原子力顯微鏡可在單分子水平上研究蛋白及其組裝結(jié)構(gòu)＼[19，20＼]。圖2為鈣粘素與丹皮酚作用前后典型的原子力顯微鏡成像。在圖2A中，未與丹皮酚作用的鈣粘素呈現(xiàn)為連續(xù)長度約500 nm的長鏈結(jié)構(gòu)及交叉鏈狀結(jié)構(gòu)。與丹皮酚作用后，鈣粘素分子間形成的鏈狀結(jié)構(gòu)的長度明顯減?。▓D2B）。此外，作用溫度對于鈣粘素的結(jié)構(gòu)也有顯著影響。 如圖2（B～D）所示。隨著作用溫度逐漸升高，鈣粘素分子間形成的長鏈結(jié)構(gòu)逐步減少。

圖2A 中原子力顯微鏡觀察到的長鏈結(jié)構(gòu)以及交叉鏈狀結(jié)構(gòu)的形成與鈣粘素單體的特異結(jié)構(gòu)有關(guān)。晶體結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明， 鈣粘素單體由5個重復(fù)的結(jié)構(gòu)域首尾相連而成（EC domain 1～5）＼[21＼]。每個結(jié)構(gòu)域?yàn)橐粋€圓筒狀結(jié)構(gòu)，其三維尺寸為4.5 nm ×2.5 nm × 2.5 nm。由于每兩個結(jié)構(gòu)域連接時存在一個微小的彎曲，致使整個鈣粘素單體呈現(xiàn)香腸狀，其首尾間的長度約為20.7 nm＼[6＼]。高靈敏力譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)了鈣粘素結(jié)構(gòu)域間存在著交錯作用，如EC1結(jié)構(gòu)域與另一個分子其它結(jié)構(gòu)域的作用＼[6＼]。這種鈣粘素分子結(jié)構(gòu)域間的交錯作用可能是形成長達(dá)幾百納米長鏈結(jié)構(gòu)的根本原因。另外，兩個鈣粘素分子間還能產(chǎn)生EC1結(jié)構(gòu)域間相互作用。每個鈣粘素單體的N端（EC1結(jié)構(gòu)域）遠(yuǎn)側(cè)的色氨酸殘基能進(jìn)入另一個單體的疏水腔，進(jìn)行鏈交換作用，形成穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)＼[21，22＼]。此外，高分辨電鏡研究結(jié)果表明，鈣粘素分子間還能產(chǎn)生更復(fù)雜的作用，如3個鈣粘素分子間能形成交叉結(jié)構(gòu)，4個分子間能產(chǎn)生四鏈結(jié)構(gòu)＼[23＼]，這可能是形成圖2A中交叉長鏈狀結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。

在圖2B中，當(dāng)鈣粘素與丹皮酚作用后，鏈狀結(jié)構(gòu)的長度顯著減小，主要是由于丹皮酚與鈣粘素分子的N端（EC1結(jié)構(gòu)域）色氨酸殘基產(chǎn)生作用，這種作用已被上述熒光猝滅結(jié)果所證實(shí)，作用后可能影響了鈣粘素EC1結(jié)構(gòu)域與其它鈣粘素分子結(jié)構(gòu)域間的交錯作用，因而不利于形成長鏈結(jié)構(gòu)。隨著作用溫度升高至304和310 K，如圖2C和2D所示，鏈狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步減少，可能是因?yàn)檩^高的溫度更不利于鈣粘素EC1結(jié)構(gòu)域與其它鈣粘素分子結(jié)構(gòu)域間的交錯作用。

圖2D中箭頭所示分子的測量平均長度約為50 nm，平均高度為1.8 nm。晶體結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明， 鈣粘素二聚體長度約為40 nm，直徑為2.5 nm＼[6＼]?？紤]到原子力顯微鏡成像蛋白時的針尖加寬效應(yīng)，此測定值與晶體結(jié)構(gòu)得出的鈣粘素二聚體結(jié)果較為接近。因此根據(jù)原子力顯微成像中的形貌結(jié)構(gòu)和幾何尺寸判斷， 存在鈣粘素的二聚體。鈣粘素分子間形成二聚體是由于兩個鈣粘素分子間N端EC1結(jié)構(gòu)域色氨酸殘基的鏈交換作用所致。

本研究中所有原子力顯微鏡成像都均是在氣相條件下獲得的。蛋白樣品在制樣過程中會受到脫水和干燥過程的影響。此外，選用不同的觀察基底可能會影響觀察結(jié)果。分別考察了云母和HOPG為基底成像鈣粘素的效果，結(jié)果表明，鈣粘素在HOPG表面吸附和成像時重現(xiàn)性更好。另外，在HOPG 表面觀察到的鈣粘素的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與其晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)也更相符。

4結(jié) 論

采用熒光光譜法和原子力顯微技術(shù)分析了丹皮酚與鈣粘素的相互作用。熒光光譜法研究結(jié)果表明，丹皮酚對鈣粘素的熒光具有顯著的猝滅作用，通過猝滅常數(shù)的計算及其隨溫度變化趨勢推斷這是一個靜態(tài)猝滅過程。在不同溫度條件下，丹皮酚與鈣粘素的結(jié)合常數(shù)均大于其與人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)值，這表明丹皮酚與鈣粘素具有更強(qiáng)的相互作用。丹皮酚與鈣粘素作用過程的熵、焓和自由能值表明它們之間的結(jié)合是以氫鍵和范德華力為主的自發(fā)進(jìn)行的過程。高分辨原子力顯微觀察顯示， 與丹皮酚作用后， 鈣粘素分子間形成的鏈狀結(jié)構(gòu)的長度明顯減小，并隨著溫度的升高愈加顯著。在310 K觀察到了鈣粘素分子間形成的二聚體結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果表明，鈣粘素可能是丹皮酚體現(xiàn)其活性的一個重要的作用靶點(diǎn)。

References

1GAO LiMin， MAN QiQian. Drug Evaluation Res.， 2016， 39（2）： 300-303

高立民，滿其倩. 藥物評價研究， 2016， 39（2）： 300-303

2Xu Y， Zhu J， Lei Z， Wan L， Zhu X， Ye F， Tong Y. J. Physiol. Biochem.， 2016： 1-9

3Yang S， Wang X， Zhong G. Int. J. Clin. Exp. Med.， 2016， 9（7）： 13900-13908

4Wu J， Xue X， Zhang B， Cao H， Kong F， Jiang W， Li J， Sun D， Guo R. Tumor. Biol.， 2016， 37（9）： 12301-12313

5LEI GenHu， LIU LiTing， DAI XiaoJun， WEI YinMao， GONG BoLin. Acta Chimica Sinica， 2010， 68（1）： 55-61

雷根虎， 劉麗亭， 戴小軍， 衛(wèi)引茂， 龔波林. 化學(xué)學(xué)報， 2010， 68（1）： 55-61

6Pokutta S， Weis W I. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. ， 2007， 23（23）： 237-261

7Guilford P， Hopkins J， Harraway J， McLeod M， McLeod N， Harawira P， Taite H， Scoular R， Miller A， Reeve A E. Nature， 1998， 392（6674）： 402-405

8Perl A， Wilgenbus P， Dahl U， Semb H， Christofori G. Nature， 1998， 392（6672）： 190-193

9Grieve A G， Rabouille C. J. Cell Sci.， 2014， 127（15）： 3331-3346

10Tsalikidis C， Papachristou F， Pitiakoudis M， Asimakopoulos B， Trypsianis G， Bolanaki E， Syrigos K N， Simopoulos C. Folia Medica， 2013， 55（34）： 26-32

11Hu Q P， Kuang J Y， Yang Q K， Bian X W， Yu S C. Int. J. Cancer， 2016， 138（12）： 2804-2812

12Patil P U， D′Ambrosio J， Inge L J， Mason R W， Rajasekaran A K. J. Cell Sci.， 2015， 128（23）： 4366-4379

13Wang J. J. Biochem. Mol. Toxicol.， 2015， 29（5）： 213-220

14Hu S， Liu K， Li Y， Ding Q， Peng W， Chen M. Can. J. Chem. ， 2014， 92（92）： 274-278

15Xiao J， Chen T， Chen L， Cao H， Yang F， Bai Y. J. Inorg. Biochem.， 2010， 104（11）： 1148-1155

16Lakowicz J R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. New York： Springer Science+Business Media， LLC， 2006： 278-327

17TAN Tao， HUANG Rui， XIA ZhiNing. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（10）： 1415-1420

譚 韜， 黃 銳， 夏之寧. 分析化學(xué)， 2007， 35（10）： 1415-1420

18Ross P D， Subramanian S. Biochemistry， 1981， 20（11）： 3096-3102

19Peng X， Fu H R， Liu R S， Zhao L， Zu Y G， Xu F J， Liu Z G. Scanning， 2015， 37（2）： 158-164

20SUN Ming， HONG Wei， SHU Jing， LI Li. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（10）： 1471-1476

孫 銘， 洪 瑋， 疏 靜， 李 力. 分析化學(xué)， 2016， 44（10）：1471-1476

21Boggon T J， Murray J， ChappuisFlament S， Wong E， Gumbiner B M， Shapiro L. Science， 2002， 296（5571）： 1308-1313

22Li Y， Altorelli N L， Bahna F， Honig B， Shapiro L， Palmer A G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2013， 110（41）： 16462-16467

23He W， Cowin P， Stokes D L. Science， 2003， 302（5642）： 109-113