MicroRNA-187在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后判斷的價(jià)值

高未華 樊銳太

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 放療科 河南 鄭州 450052)

MicroRNA-187在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后判斷的價(jià)值

高未華 樊銳太

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 放療科 河南 鄭州 450052)

目的 探討microRNA-187(miR-187)在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。方法 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院53例不同病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤及10例正常腦組織標(biāo)本，通過qRT-PCR檢測(cè)miR-187的表達(dá)水平；分析miR-187表達(dá)量與膠質(zhì)瘤患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性；通過Kaplan-Meier分析及l(fā)og-rank檢驗(yàn)評(píng)價(jià)不同表達(dá)水平與生存期的關(guān)系。結(jié)果 與正常腦組織相比，miR-187低表達(dá)于膠質(zhì)瘤組織(P<0.05)，miR-187在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平與腫瘤大小、WHO分級(jí)、KPS評(píng)分和增殖分?jǐn)?shù)Ki-67相關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡，性別及腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)，在生存分析中，低表達(dá)miR-187的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較差。結(jié)論 miR-187在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低，與腫瘤大小、WHO分級(jí)、增殖分?jǐn)?shù)Ki-67和KPS評(píng)分及預(yù)后密切相關(guān)。miR-187在膠質(zhì)瘤的診斷與治療中有重要意義，可能作為新型膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān)的分子靶標(biāo)。

膠質(zhì)瘤；miR-187；預(yù)后

膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，年發(fā)病率為4～5/10萬，具有高侵襲性、高死亡率的特點(diǎn)，不同病理類型的膠質(zhì)瘤預(yù)后存在差異，其中間變型星形細(xì)胞瘤中位生存期為2～5 a，而惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤僅為12～15個(gè)月[1]。近年來，采用手術(shù)結(jié)合放化療的綜合療法顯著提高了膠質(zhì)瘤的治療效果，但其預(yù)后仍不容樂觀，進(jìn)一步探索與膠質(zhì)瘤診斷與預(yù)后相關(guān)的新型生物標(biāo)記物，會(huì)為膠質(zhì)瘤的精確治療提供新的思路。

MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，其在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與多種生理和病理功能的調(diào)控[2]。目前有研究表明，miR-187的異常表達(dá)與乳腺癌[3]、前列腺癌[4]、腎癌[5]及結(jié)直腸癌[6]等多種腫瘤相關(guān)，而miR-187在膠質(zhì)瘤中的作用尚無報(bào)道。故本文旨在研究miR-187在膠質(zhì)瘤不同病理級(jí)別中的表達(dá)水平及預(yù)后價(jià)值，為進(jìn)一步探索腦膠質(zhì)瘤基因治療的潛在靶點(diǎn)提供方向。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo)本收集 運(yùn)用隨機(jī)抽樣方法選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年9月至2014年9月膠質(zhì)瘤標(biāo)本53例，其中男35例，女18例，中位年齡為52歲(38～79歲)。根據(jù)WHO分級(jí)，其中低級(jí)別膠質(zhì)瘤22例，Ⅰ級(jí)6例，均為腦膜瘤。Ⅱ級(jí)16例，包括彌漫性星形細(xì)胞瘤9例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤7例。高級(jí)別膠質(zhì)瘤31例，Ⅲ級(jí)17例，包括間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤10例，混合性膠質(zhì)細(xì)胞瘤7例。Ⅳ級(jí)14例，均為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。另選取同期因腦出血、腦外傷切除的正常腦組織10例作為對(duì)照組。每例標(biāo)本先經(jīng)液氮臨時(shí)保存，然后-80 ℃儲(chǔ)存以備提取組織總RNA。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，入組患者術(shù)前均未進(jìn)行過放化療等治療。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑及儀器 TRIzol總RNA提取試劑購于美國thermo公司；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ購自日本TAKARA公司；Real-time PCR引物購自上海生工合成；熒光定量PCR儀購于賽默飛世爾科技公司。

1.2 Real-time PCR 分別取液氮中保存的膠質(zhì)瘤組織，正常腦組織，用TRIzol提取總RNA，提取后使用核酸定量儀測(cè)定濃度及純度，而后置于-80 ℃的冰箱中保存，所有操作參照說明書及參考文獻(xiàn)。用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增的步驟如下：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s后60 ℃ 10 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，于4 ℃保存。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)孔，目的產(chǎn)物的量通過公式2-△△CT計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism繪制統(tǒng)計(jì)圖，組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)，利用Kaplan-Meier法及Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-187低表達(dá)于膠質(zhì)瘤組織 利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中miR-187的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，腦膠質(zhì)瘤組織，正常腦組織中miR-187的表達(dá)量分別為(0.836 8±0.604 2)比(2.406 2±0.944 1)，與正常腦組織相比，miR-187在腦膠質(zhì)瘤中低表達(dá)(P<0.05，t=5.065)。且miR-187在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯低于低級(jí)別膠質(zhì)瘤(P<0.05，t=2.043)。

2.2 miR-187表達(dá)與膠質(zhì)瘤相關(guān)性分析 根據(jù)miR-187表達(dá)水平對(duì)53例膠質(zhì)瘤組織樣本分組，表達(dá)量的平均數(shù)為0.836 8，高表達(dá)組指miR-187表達(dá)水平高于平均水平的患者，共30例，其余為低表達(dá)組，共23例。結(jié)果提示，膠質(zhì)瘤組織中miR-187的表達(dá)水平與腫瘤大小、WHO分級(jí)、增值分?jǐn)?shù)Ki-67和KPS評(píng)分密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與患者的年齡，性別及腫瘤部位差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 miR-187表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 53例膠質(zhì)瘤患者隨訪截止至2016年3月或死亡，低表達(dá)組中位生存期為12.4個(gè)月，高表達(dá)組為23.1個(gè)月。結(jié)果顯示，miR-187高表達(dá)組的預(yù)后明顯優(yōu)于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=2.532，95%CI：1.206～5.313，P<0.05)。見圖1。

表1 膠質(zhì)瘤患者miR-187表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

圖1 miR-187高/低表達(dá)組膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的K-W曲線

3 討論

miRNA是核苷酸片段構(gòu)成的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過與細(xì)胞內(nèi)特定mRNA的3’-UTR 堿基配對(duì)結(jié)合，影響蛋白質(zhì)的翻譯過程，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)在生命體中的表達(dá)水平[7]，在細(xì)胞的生長、分化、增殖和凋亡等過程中均發(fā)揮著重要作用。目前已明確腫瘤細(xì)胞中存在多種miRNA分子片段，不同miRNA產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)也不一樣，表達(dá)水平也存在差異。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-210、miR-155、miR-132和miR-200a顯示高表達(dá)，而miR-34a、miR-206、miR-200b和miR-134顯示低表達(dá)[8]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-187可能具有細(xì)胞或器官特異性[9]，在不同組織、器官中表達(dá)存在差異。miR-187在卵巢癌中高表達(dá)與較好的生存率相關(guān)，但在宮頸癌HeLa細(xì)胞中，miR-187過表達(dá)將誘使細(xì)胞失活甚至凋亡[10]，不同的腫瘤類型中miR-187表達(dá)水平的差異提示我們需要進(jìn)一步證實(shí)miR-187在其他腫瘤中的表達(dá)變化與發(fā)病機(jī)理。雖然已有學(xué)者針對(duì)一些miRNA在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的影響進(jìn)行了研究，但miR-187在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況并不明了。

研究證實(shí)，在肺癌細(xì)胞中miR-187通過阻礙細(xì)胞從G1向S期轉(zhuǎn)化阻止癌癥進(jìn)展，其中B7-H3被證實(shí)是miR-187的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，B7-H3是一類通過激活jak2/STAT3通路的致癌基因，可促進(jìn)腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移，miR-187通過沉默B7-H3使細(xì)胞周期停止于G0/G1期，從而減緩細(xì)胞增殖[11]。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)miR-187可抑制晚期結(jié)直腸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，從而提高患者生存率[12]。近年來，miR-187在各種實(shí)體腫瘤中的生物學(xué)特性逐漸被重視，隨著其調(diào)控機(jī)制及對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的研究不斷深入，其醫(yī)學(xué)價(jià)值不斷提升。本課題首次探索miR-187在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步明確其生物學(xué)特性，利用其高度敏感性及特異性的優(yōu)勢(shì)，探究其能否成為臨床上指導(dǎo)治療，提示預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，為今后進(jìn)一步明確miR-187在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的分子生物學(xué)機(jī)制打下了夯實(shí)的基礎(chǔ)，給腦膠質(zhì)瘤的臨床診療工作提供新的思路。

本研究通過qRT-PCR分析了miR-187在不同級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤及正常腦組織的表達(dá)情況，深入探討miR-187在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與各項(xiàng)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-187在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織(WHO Ⅲ、Ⅳ級(jí))的表達(dá)水平明顯低于低級(jí)別膠質(zhì)瘤(WHO Ⅰ、Ⅱ級(jí))和正常腦組織(P<0.05)。隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高，miR-187的表達(dá)水平顯著性降低，提示miR-187與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析顯示，miR-187與膠質(zhì)瘤的惡性程度負(fù)相關(guān)，膠質(zhì)瘤組織引起miR-187表達(dá)水平受到抑制，且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度增加，miR-187受抑制程度也逐漸增大。與此同時(shí)，miR-187與腫瘤大小、增殖分?jǐn)?shù)Ki-67負(fù)相關(guān)，與KPS評(píng)分正相關(guān)。腫瘤形態(tài)越大，Ki-67數(shù)值越高意味著miR-187表達(dá)水平相對(duì)越低，而身體情況較好，KPS評(píng)分較高的患者其miR-187表達(dá)水平也相對(duì)較高(P<0.05)。Kaplan-Meier分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-187表達(dá)水平越低，提示生存預(yù)后越差?；谀壳暗难芯砍晒?，我們有理由推斷miR-187表達(dá)水平越低，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移及侵襲的能力越差，膠質(zhì)瘤患者預(yù)后也越差。

綜上，本研究首次證實(shí)了miR-187在人膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)。膠質(zhì)瘤中miR-187低表達(dá)意味著生存率低，提示miR-187可能成為膠質(zhì)瘤侵襲及預(yù)后特異標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，為膠質(zhì)瘤的診治提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及方向，但miR-187在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)相關(guān)分子機(jī)制仍不明確，因此，其下游靶基因是本課題進(jìn)一步的研究方向。

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Expression of microRNA-187 in glioma tissue and its value in predicting prognosis

Gao Weihua, Fan Ruitai

(DepartmentofRadiotherapy,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

Objective To investigate the prognostic roles of ectopic expression of miR-187 in glioma, and the relationship between miR-187 expression level and clinical significance.Methods The specimens from the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University were collected, including 53 glioma tissues, 10 cases of normal brain tissues. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to measure the expression of miR-187 in all specimens. In addition, the clinical pathological features of gliomas were reviewed, and the correlation between the features and the expression of miR-187 were analyzed. Survival curves of the patients were calculated using the Kaplan-Meier method and the data were analyzed with the log-rank test.Results The results revealed that miR-187 expression level in glioma tissues was significantly lower than those in normal brain tissues (P<0.05). Moreover, higher expression of miR-187 was significantly associated with larger tumor size, higher WHO grade, lower Karnofsky performance score (KPS), and higher percentage of Ki-67(P<0.05).Conclusion MiR-187 down-regulation was associated with negatively pathological grade, large tumor, over-expression of Ki-67, and low KPS. It is the first data to prove that expression level of miR-187 may be a novel and valuable prognostic factor in glioma.

miR-187；glioma；prognosis

R 739.41

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.08.006

2016-12-03)