低頻經(jīng)顱磁刺激對(duì)VCI大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬突觸可塑性的影響

王宏偉 劉寶俊 毛細(xì)江 王昌權(quán) 涂強(qiáng) 黃毅 路承彪

(1.長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 湖北 荊州 434023； 2.黃河三門(mén)峽醫(yī)院 兒科 河南 三門(mén)峽 472000；3.長(zhǎng)江大學(xué)第一附屬醫(yī)院 NCU 湖北 荊州 434000)

低頻經(jīng)顱磁刺激對(duì)VCI大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬突觸可塑性的影響

王宏偉1劉寶俊2毛細(xì)江1王昌權(quán)1涂強(qiáng)3黃毅3路承彪1

(1.長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 湖北 荊州 434023； 2.黃河三門(mén)峽醫(yī)院 兒科 河南 三門(mén)峽 472000；3.長(zhǎng)江大學(xué)第一附屬醫(yī)院 NCU 湖北 荊州 434000)

目的 研究低頻經(jīng)顱磁刺激(rTMS)對(duì)血管性認(rèn)知障礙(VCI)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響機(jī)制。方法 健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(normal)、假手術(shù)組(sham-operated)、模型組(VCI)、rTMS刺激組(VCI +rTMS)。Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)認(rèn)知實(shí)驗(yàn)，電生理學(xué)測(cè)定大鼠腦片海馬齒狀回(DG)在高頻刺激下(HFS)誘發(fā)的突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)現(xiàn)象。結(jié)果 水迷宮實(shí)驗(yàn)中，第4天起rTMS刺激組大鼠逃避潛伏期與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電生理實(shí)驗(yàn)中，10 min時(shí)rTMS刺激組PS幅值升高，LTP幅值變化率與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 rTMS增加VCI大鼠海馬區(qū)LTP效應(yīng)從而增強(qiáng)突觸的功能可塑性，改善VCI大鼠的認(rèn)知功能?！娟P(guān)鍵詞】 低頻經(jīng)顱磁刺激；血管性認(rèn)知障礙；海馬；學(xué)習(xí)記憶；長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)

隨著老齡化的到來(lái)，我國(guó)卒中發(fā)病率日益增加。卒中患者中高達(dá)64%伴有不同程度的認(rèn)知功能障礙，進(jìn)展為血管性癡呆的可能性也成倍增加[1]。血管性癡呆(vascular dementia, VD)對(duì)老年人的健康和生活質(zhì)量造成極大威脅，給社會(huì)家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[2]。VD臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能障礙。記憶認(rèn)知與中樞神經(jīng)突觸的可塑性變化密切相關(guān)。中樞突觸LTP是神經(jīng)突觸功能可塑性的一個(gè)重要表現(xiàn)形式，反應(yīng)了突觸水平的記憶過(guò)程，是腦科學(xué)研究中衡量突觸功能可塑性的主要指標(biāo)[3]。海馬作為研究學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)鍵部位是具有可塑性的一個(gè)重要腦區(qū)。Morris水迷宮檢測(cè)的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力是一種空間參考記憶，屬于陳述性記憶，癡呆患者正是表現(xiàn)為陳述性記憶受損明顯。低頻經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS)是近年逐漸應(yīng)用于臨床的一種影響和改變大腦功能的生物刺激技術(shù)，作為一種新型治療手段已在多種神經(jīng)精神疾病的治療中得到了肯定。

實(shí)驗(yàn)擬以模型組血管性認(rèn)知障礙(vascular cognitive impairment，VCI)大鼠為研究對(duì)象，從行為學(xué)和電生理實(shí)驗(yàn)兩方面探討低頻rTMS對(duì)VCI大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知能力和對(duì)大鼠海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)為指標(biāo)的突觸可塑性的影響，希望為血管性認(rèn)知障礙患者的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和治療手段。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 經(jīng)顱磁刺激治療儀、Morris水迷宮系統(tǒng)、人工腦脊液(配置)、LEICA VT1200S 振動(dòng)切片機(jī)、DS3電子刺激器、SS-202J刺激隔離器、NL104信號(hào)放大器、Micro140生物信號(hào)處理器、Spike2數(shù)據(jù)分析軟件。

1.2 動(dòng)物及分組 2個(gè)月齡大雄性SD大鼠60只，隨機(jī)等分為正常組、假手術(shù)組、模型組、rTMS刺激組。實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)自湖北省疾控中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 模型大鼠制備 采用反復(fù)夾閉及再通雙側(cè)頸總動(dòng)脈伴低血壓法模擬反復(fù)腦缺血，制備大鼠血管性癡呆模型。參照王蕊等[4]方法制作VCI動(dòng)物模型。大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，1%戊巴比妥納腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸部正中切口分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid arteries，CCA)，模型組在夾閉雙側(cè)CCA前，腹腔內(nèi)注射硝普鈉(2.5 mg/kg，用雙蒸餾水溶解)，隨即用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCA 10 min，再通10 min，再夾閉10 min，縫合傷口放回籠中保溫繼續(xù)飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不夾閉雙側(cè)CCA及腹腔注射硝普鈉。傷口撒磺胺粉預(yù)防感染，手術(shù)結(jié)束后飼養(yǎng)7 d。

1.4 低頻經(jīng)顱磁刺激方法 造模成功后，治療采用低頻1 Hz，10個(gè)脈沖/串，每串間隔2～3 s，20串/d，強(qiáng)度為0.5 T，1個(gè)療程為5 d，共4個(gè)療程，每個(gè)療程間隔2 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中rTMS刺激組大鼠均有很好耐受性，未見(jiàn)異?，F(xiàn)象發(fā)生。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 大鼠適應(yīng)環(huán)境后開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)持續(xù)5 d，大鼠向池壁不同象限入水，記錄在120 s內(nèi)大鼠尋找到平臺(tái)所用的時(shí)間(即逃避潛伏期)。結(jié)果以大鼠尋找到站臺(tái)的時(shí)間表示。120 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，潛伏期記為120 s。

1.6 電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.6.1 大鼠腦片制備 斷頭取腦，振動(dòng)切片機(jī)切制成含海馬層面的活體腦片，置于灌流有95%O2+5%CO2混合氣體與人工腦脊液的灌流槽內(nèi)。刺激電極置于大鼠內(nèi)嗅區(qū)前穿通纖維區(qū)，記錄電極置于海馬齒狀回。調(diào)整刺激電極和記錄電極的位置，找到固定強(qiáng)度的刺激記錄到最大的群峰電位(population spike、PS)時(shí)將兩電極固定。刺激由DS3電子刺激器產(chǎn)生，經(jīng)刺激隔離器和刺激電極輸向前穿通纖維區(qū)，誘發(fā)的動(dòng)作電位經(jīng)生物放大器在記憶示波器上顯示，輸入計(jì)算機(jī)經(jīng)Spike2數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析作為齒狀回顆粒細(xì)胞群興奮性的指標(biāo)[5]。

2 結(jié)果

2.1 低頻rTMS對(duì)各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的影響 實(shí)驗(yàn)中VCI模型組大鼠逃避潛伏期一直處在較高的水平。 第1、2天，各組在大鼠逃避潛伏期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第3天開(kāi)始，各組大鼠逃避潛伏期有顯著縮短，正常組大鼠逃避潛伏期與假手術(shù)組和模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。第4天時(shí)，rTMS刺激組逃避潛伏期與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 水迷宮實(shí)驗(yàn)中大鼠逃避潛伏期比較±s，s)

注：模型組與假手術(shù)組、正常組比較，aP<0.01；模型組與rTMS組比較，bP<0.05。2.2 低頻rTMS對(duì)各組大鼠海馬DG區(qū)HFS誘導(dǎo)的LTP的影響 各組在給予HFS后PS幅值變化率均出現(xiàn)增加，記錄時(shí)間內(nèi)未見(jiàn)明顯減弱。各時(shí)間節(jié)點(diǎn)上VCI模型組PS幅值變化率與正常組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10 min時(shí)，rTMS刺激組PS幅值變化率開(kāi)始較大幅度增加，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；假手術(shù)組與正常組PS幅值變化率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明手術(shù)操作對(duì)大鼠海馬LTP無(wú)影響。見(jiàn)圖1、2。

注：正常組與模型組比較，cP<0.05；rTMS刺激組與模型組比較，dP<0.01。

圖2 HFS刺激前后變化圖(MN為PS變化幅度，A：HFS前，B：HFS后)

3 討論

血管性癡呆和阿爾茨海默病是引起癡呆的兩大主要原因。癡呆已成為一個(gè)越來(lái)越嚴(yán)峻的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、家庭以及公共衛(wèi)生問(wèn)題。關(guān)于學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知缺陷的修復(fù)是當(dāng)今世界上腦科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。但與阿爾茨海默病變性為主的病理改變不同的是血管性癡呆病因多、病理機(jī)制復(fù)雜，臨床治療中束手無(wú)策，無(wú)特效的藥物和治療辦法。

rTMS通過(guò)線圈內(nèi)電流的瞬變從而形成高強(qiáng)度的交變磁場(chǎng)，可在深部腦區(qū)產(chǎn)生感應(yīng)電流而起作用[6]。作為非藥物干預(yù)技術(shù)已應(yīng)用于一些神經(jīng)和精神系統(tǒng)疾病的治療并取得了不錯(cuò)的效果[7]。實(shí)驗(yàn)中經(jīng)低頻rTMS刺激的大鼠都表現(xiàn)出很好的耐受性。但目前在血管性認(rèn)知障礙機(jī)制方面有關(guān)rTMS的研究報(bào)道較少。

實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物行為學(xué)和電生理學(xué)方面為rTMS的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。VCI模型大鼠表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降。在低頻rTMS刺激后VCI大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善。神經(jīng)細(xì)胞之間的突觸可塑性變化則是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。海馬齒狀回LTP明顯增加，表明低頻rTMS刺激可使VCI大鼠海馬DG區(qū)的神經(jīng)突觸間功能可塑性增強(qiáng)。這可能是rTMS改善VCI大鼠認(rèn)知學(xué)習(xí)功能的分子突觸機(jī)制。rTMS豐富了當(dāng)前VCI的治療手段，眾多的血管認(rèn)知障礙患者或許會(huì)從中受益，在突觸結(jié)構(gòu)可塑性方面仍要進(jìn)一步探索研究完善。

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Effects of low frequency repetitive transcranial magnetic stimulation on learning and memory and synaptic plasticity in hippocampus of vascular cognitive impairment rats

Wang Hongwei1, Liu Baojun2, Mao Xijiang1, Wang Changquan1, Tu Qiang3, Huang Yi3, Lu Chengbiao1

(1.MedicalCollegeofYangtzeUniversity,Jingzhou434023,China; 2.DepartmentofPediatrics,HuangheSanmenxiaHospital,Sanmenxia472000,China; 3.DepartmentofNCU,theFirstAfflicatedHospitalofYangtzeUniversity,Jingzhou434000,China)

Objective To study the effect of low frequency repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) on learning and memory and the long-term potentiation (LTP) in hippocampus of vascular cognitive impairment(VCI) rats. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into normal group, sham-operated group, model group(VCI), control treatment group(VCI+ rTMS). The spatial learning and memory ability of rats was measured by Morris water maze. Electrophysiological recordings were conducted to detect the effects of repetitive transcranial magnetic stimulation(rTMS)on phenomena of synaptic transmission long-term LTP in dentate gyrus (DG) of hippocampus slices under the high frequency stimulation (HFS). Results In the escape latency after the 4th days, the rTMS treatment group was shortened to the model group (P<0.05).10 minutes later, the PS amplitude of the control treatment group increased and the LTP was enhanced, there were significant difference compared with model group(P<0.01). Conclusion The rTMS can improve VCI model rats learning and memory ablity by means of enhancing hippocampal LTP and the function of synaptic plasticity.

repetitive transcranial magnetic stimulation ；vascular cognitive impairment；hippocampus；learning and memory；long-term potentiation

路承彪，E-mail：2331202185@qq.com。

R 743.9

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.08.002

2016-11-30)