某區(qū)慢性阻塞性肺疾病下呼吸道感染的病原菌檢測(cè)、藥敏結(jié)果及臨床價(jià)值

曾 曉 謝志斌 劉 鈞 彭梅君 楊 青 葉艷珍 張 鵬

（湖北省孝感市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科三，湖北 孝感 432000）

某區(qū)慢性阻塞性肺疾病下呼吸道感染的病原菌檢測(cè)、藥敏結(jié)果及臨床價(jià)值

曾 曉 謝志斌*劉 鈞 彭梅君 楊 青 葉艷珍 張 鵬

（湖北省孝感市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科三，湖北 孝感 432000）

收集孝感市中心醫(yī)院慢性阻塞性肺疾病痰標(biāo)本306例，標(biāo)本直接涂片革蘭染色細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)，同時(shí)觀察白細(xì)胞和病原菌關(guān)系的現(xiàn)象，并收集患者相關(guān)臨床資料。綜合三方面對(duì)所生長(zhǎng)的潛在病原菌進(jìn)行判斷。以患者依據(jù)藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果、用藥后的療效以及有無(wú)感染癥狀體征為判斷依據(jù)。白細(xì)胞吞噬細(xì)菌或與細(xì)菌并存現(xiàn)象的標(biāo)本有135份培養(yǎng)的細(xì)菌均確定為感染病原菌，感染率顯著高于未觀察到白細(xì)胞吞噬病原菌或與病原菌并存現(xiàn)象的標(biāo)本（100% vs 23.2%，P＜0.005）。下呼吸道感染分離的病原菌主要以革蘭陰性桿菌為主，位列前五位的依次為肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌；分離的革蘭陽(yáng)性球菌主要以金黃色葡萄球菌為主，第二位的是肺炎鏈球菌；分離出的真菌仍主要以念珠菌屬為主（占真菌62%）本研究分離的肺炎克雷伯菌對(duì)常用抗生素的耐藥率較高，除亞胺培南、阿米卡星耐藥率低于30%，其他抗生素均高于30%，大腸埃希菌對(duì)亞胺培南的耐藥率低于10%，對(duì)環(huán)丙沙星耐藥率超過(guò)70%；銅綠假單胞菌對(duì)阿米卡星、亞胺培南、頭孢他啶的耐藥率均低于30%，革蘭陰性菌整體對(duì)氨芐西林、頭孢唑林的耐藥率較高，分別達(dá)85.8%、82.6%。未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌。結(jié)論 下呼吸道感染分離的病原菌主要以革蘭陰性桿菌為主。革蘭陰性桿菌對(duì)亞胺培南、阿米卡星具有較高的敏感性。革蘭陽(yáng)性球菌對(duì)萬(wàn)古霉素?zé)o耐藥。確定病原菌必須綜合患者的臨床資料，直接涂片的表現(xiàn)，細(xì)胞學(xué)及白細(xì)胞與病原菌的關(guān)系和培養(yǎng)生長(zhǎng)情況三個(gè)方面來(lái)確定感染病原菌。

慢性阻塞性肺疾?。幌潞粑栏腥?；病原菌檢測(cè)；藥敏；臨床價(jià)值

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）急性加重期的定義：AECOPD是指COPD患者“急性起病，患者的呼吸困難、咳嗽和（或）咳痰癥狀變化超過(guò)了正常的日間變異，須改變?cè)兄委煼桨傅囊环N臨床情況”。其最常見(jiàn)的原因是支氣管樹(shù)的感染和大氣污染[1]，由于口咽部有大量正常生理菌群，咳痰標(biāo)本受口咽部生理菌群污染不可避免。對(duì)于典型的致病菌如白喉棒狀桿菌、百日咳鮑特菌等，不受口咽部生理菌群影響，分離培養(yǎng)出即可視為病原菌。然而，隨著醫(yī)療技術(shù)的提高，抗生素的廣泛使用，典型的致病菌感染越來(lái)越少見(jiàn)，而條件致病菌的感染卻逐漸上升。因此，對(duì)于痰標(biāo)本培養(yǎng)出的條件致病菌如何判斷其為呼吸道感染定植菌還是感染菌已經(jīng)成為臨床檢驗(yàn)的難點(diǎn)，本文采用一種新的可用于判斷痰液培養(yǎng)定植菌和病原菌的方法，結(jié)合藥敏試驗(yàn)，以了解本院慢性阻塞性肺病患者的病原學(xué)特點(diǎn)及指導(dǎo)如何合理使用抗生素。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象：選取本院2014年1月1日至2015年1月1日間住院患者痰標(biāo)本306份。

1.2 標(biāo)本處理

1.2.1 標(biāo)本直接涂片，厚薄均勻，自然干燥后火焰固定，革蘭鏡檢。

1.2.2 鏡檢內(nèi)容：①細(xì)胞學(xué)檢查：包括鱗狀上皮（SEC）和中性粒細(xì)胞。依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第二版下呼吸道標(biāo)本顯微鏡白細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)[2]及美國(guó)第7版《臨床微生物學(xué)》。相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：將標(biāo)本分為A、B、C 三類（表1）；②細(xì)菌學(xué)檢查：包括口咽部生理菌群（甲型溶血性鏈球菌、非治病奈瑟菌及厭氧菌等）和潛在病原菌；③細(xì)菌和細(xì)胞之間的關(guān)系：觀察致病菌和中性粒細(xì)胞之間的關(guān)系，包括中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌或細(xì)菌與細(xì)胞并存的現(xiàn)象。

1.3 標(biāo)本培養(yǎng)：所有標(biāo)本均接種羊血平板、巧克力平板和中國(guó)藍(lán)平板，培養(yǎng)基半成品購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.4 細(xì)菌鑒定：VⅠTEK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，按儀器說(shuō)明書操作。藥敏紙片法:按2005年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）的紙片擴(kuò)散法進(jìn)行及判斷結(jié)果。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林葡萄球菌（M RS）的檢測(cè)、篩選及確診試驗(yàn)參照2005 年NCCLS推薦標(biāo)準(zhǔn)。觀察三種平板生長(zhǎng)情況，如果培養(yǎng)基有細(xì)菌生長(zhǎng)，量達(dá)到1區(qū)以上即為陽(yáng)性（一區(qū)密集生長(zhǎng)為1+，二區(qū)生長(zhǎng)為2+，三區(qū)生長(zhǎng)為3+），進(jìn)行鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，鑒定采用法國(guó)梅里埃公司VⅠTEK鑒定系統(tǒng)，藥物敏感試驗(yàn)采用K-B法。

1.5 質(zhì)量控制：選取ATCC 25922大腸埃希菌和ATCC25923金黃色葡萄球菌為質(zhì)控菌株對(duì)上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.6 病原菌確定標(biāo)準(zhǔn)：患者具有感染癥狀且依據(jù)藥敏結(jié)果用藥后治療有效。

1.7 定植菌確定標(biāo)準(zhǔn)：患者無(wú)感染癥狀或有感染癥狀但依據(jù)藥敏結(jié)果用藥后治療無(wú)效。

1.8 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》將老年患者痰標(biāo)本接種在血瓊脂和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基培養(yǎng) 18～24 h，觀察菌落形態(tài)，進(jìn)行革蘭染色。應(yīng)用VTEK自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀將細(xì)菌鑒定到種并進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，抗生素包括亞胺培南西司他丁、哌拉西林他唑巴坦、阿莫西林克拉維酸鉀、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢美唑、頭孢唑啉、左氧氟沙星、舒普深、環(huán)丙沙星、青霉素、氨芐青霉素、苯唑西林、萬(wàn)古霉素、阿米卡星、慶大霉素、SMZ-CO、紅霉素、利福平等，按NCC、LS標(biāo)準(zhǔn)用K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果統(tǒng)計(jì)用VTEK統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析[2]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料均用率表示，采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05，具有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 痰液標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)合格標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié) 果

2.1 陽(yáng)性患者一般情況：306例患者年齡17～94歲，平均年齡68.4歲，其中70歲以上老年患者211例，占68.9%。男性患者224例，占73.2%。女性患者82例，占26.7%，有感染癥狀及體征者249例，占81.3%，無(wú)感染癥狀及體征者57例，占18.6%。培養(yǎng)前有使用抗生素274例，占89.5%，未使用抗生素者32例，占10.5%。

2.2 痰培養(yǎng)陽(yáng)性細(xì)菌分布：共培養(yǎng)出致病菌305株，革蘭陰性菌220株，占72.13%；革蘭陽(yáng)性球菌60株，占19.67%；真菌26株，占8.52%；其中培養(yǎng)出多重耐藥菌69株，陽(yáng)性率22.6%。

2.3 不同質(zhì)量標(biāo)本培養(yǎng)出的細(xì)菌之間定植率和感染率的比較：305株菌依據(jù)上述判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定為病原菌的構(gòu)成比為48.3%，合格標(biāo)本244份（79.7%），其中A類131份、B類113份。不合格標(biāo)本C類62份。兩類標(biāo)本培養(yǎng)的細(xì)菌定植率和感染率比較結(jié)果見(jiàn)表2。在A類和B類中依據(jù)直接涂片鏡檢結(jié)果（是否具有感染免疫病理現(xiàn)象即中性粒細(xì)胞吞噬相應(yīng)細(xì)菌或與細(xì)菌并存）分為兩類，二者之間定植率與感染率的比較見(jiàn)表3。

2.4 不同種類細(xì)菌的感染率和定植率不同，肺炎球菌，流感桿菌，卡他的感染率為100%，非發(fā)酵菌定植率為71.3%。見(jiàn)表4。

2.5 慢性阻塞性肺疾病培養(yǎng)的細(xì)菌以革蘭陰性菌為主，占72.13%，革蘭陽(yáng)性球菌占19.67%，真菌占8.25%。其中革蘭陰性菌以肺炎克雷伯菌（14.75%）、銅綠假單胞菌（13.44%）、不動(dòng)桿菌（10.82%）為主。革蘭陽(yáng)性球菌以金黃色葡萄球菌（6.88%）、肺炎鏈球菌（5.57%）、表皮葡萄球菌（3.28%）、腸球菌（1.64%）。見(jiàn)表5。

2.6 采用臨床常用的18種抗生素對(duì)分離的COPD感染的主要革蘭陰性病原菌進(jìn)行耐藥分析，本實(shí)驗(yàn)對(duì)4中主要的革蘭陰性致病菌（肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌）進(jìn)行耐藥測(cè)定，發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌整體對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、氯霉素耐藥率最高，分別達(dá)到85.8%、82.6%、65.3%。對(duì)亞胺培南、頭孢他啶、妥布霉素的耐藥率最低，分別達(dá)到16.7%、30.3%、31.1%。見(jiàn)表6。

2.7 采用臨床常用的13種抗生素對(duì)分離的COPD感染的主要革蘭陽(yáng)性球菌進(jìn)行耐藥分析，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)3種常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性球菌（金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、表皮葡萄球菌）進(jìn)行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)革蘭陽(yáng)性球菌整體對(duì)青霉素、紅霉素、氧氟沙星耐藥率最高，分別達(dá)95%、88.6%、79.3%。對(duì)萬(wàn)古霉素、呋喃妥因、亞胺培南耐藥率最低，分別為0%、19.1%、25.4%。未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的革蘭陽(yáng)性球菌。見(jiàn)表7。

3 討 論

當(dāng)今社會(huì)科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，隨著抗生素的廣泛使用，下呼吸道的感染病原菌不斷變遷，過(guò)去典型的致病菌已經(jīng)相對(duì)少見(jiàn)，相反，現(xiàn)在由條件致病菌導(dǎo)致的感染卻不斷增多，已成為下呼吸道感染的主要病原菌。典型的病原菌有典型的臨床表現(xiàn)和特點(diǎn)，而且不受口咽部定植菌的影響，實(shí)驗(yàn)室檢查出即可確診。而條件致病菌的致病性是相對(duì)的，無(wú)典型的臨床表現(xiàn)，而且不能通過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)來(lái)確定是致病菌還是口腔定植菌，因此成為了臨床醫(yī)學(xué)的難點(diǎn)。

目前，痰培養(yǎng)是最廣泛應(yīng)用的病原學(xué)診斷技術(shù)，本例研究中，306例患者中，痰培養(yǎng)前使用抗生素274例，占89.5%，在這些患者中，機(jī)體免疫力低下，一般致病菌定植力遭到破壞，而定植力較強(qiáng)，侵襲力較弱的條件致病菌卻很容易在呼吸道定植而成為致病菌。而痰培養(yǎng)出這些條件致病菌或連續(xù)兩次以上分離出，即使患者有呼吸道癥狀和體征，也不能判斷這些條件致病菌就是致病菌。

正常呼吸道存在大量生理菌群，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，占位保護(hù)等作用拮抗外來(lái)菌群的定植，機(jī)體的完整的黏膜也是重要的防御屏障。當(dāng)外界多種致病因素如機(jī)體免疫力破壞，抗生素的過(guò)度使用等因素造成機(jī)體防御能力的下降，則病菌可入侵機(jī)體。如此同時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的炎性反應(yīng)，包括炎性細(xì)胞的趨化（主要是白細(xì)胞）至炎癥部位，識(shí)別并吞噬殺滅病原體[3]。因此，下呼吸道感染患者，不論是典型的致病菌還是條件致病菌感染，都會(huì)引起炎性反應(yīng)，有白細(xì)胞趨化并吞噬殺滅病原菌的病理現(xiàn)象。其咳痰中必定帶有大量的白細(xì)胞，直接涂片細(xì)胞學(xué)檢查有助于致病菌與定植菌的判斷。表2提示，合格標(biāo)本分離出的病原菌顯著高于不合格標(biāo)本（61.9% vs 3.2%，P＜0.005），不合格標(biāo)本幾乎都是上呼吸道定植菌（96.8%）。白細(xì)胞吞噬異物（病原菌）是一種非特異性的免疫病理防御機(jī)制，即便是正常人的呼吸道中也有少量白細(xì)胞存在，因此咳痰標(biāo)本即使合格其可接受的標(biāo)本單純細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)也無(wú)法確定所培養(yǎng)的條件致病菌為感染病原菌。表2表明，合格標(biāo)本仍有93例（39.7%）為定植菌。如前所述，白細(xì)胞浸潤(rùn)吞噬病原菌是機(jī)體炎性反應(yīng)過(guò)程中必然的免疫病理現(xiàn)象，來(lái)自呼吸道炎癥部位的咳痰一定有白細(xì)胞吞噬病原菌或與病原菌并存的現(xiàn)象，見(jiàn)圖1，根據(jù)這一現(xiàn)象可以作為判斷細(xì)菌為病原菌的直接證據(jù)。表3表明，本組研究中有白細(xì)胞吞噬伴行現(xiàn)象的感染率顯著高于沒(méi)有白細(xì)胞吞噬伴行的感染率（100% vs 21.2%，P＜0.005）。因此，痰標(biāo)本中見(jiàn)到白細(xì)胞吞噬病原菌或與病原菌伴行現(xiàn)象的可以判斷該細(xì)菌為致病菌。在未見(jiàn)白細(xì)胞吞噬伴行現(xiàn)象的合格標(biāo)本中有24例（21.2%）為感染致病菌，這一現(xiàn)象可能與涂片敏感性有關(guān)。根據(jù)培養(yǎng)，可將病原菌分為四類，非發(fā)酵菌，腸桿菌科，肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，卡他菌及葡萄球菌，不同種類細(xì)菌之間的感染率和定值率之間有顯著性差異（P＜0.005），這與不同細(xì)菌之間的毒力，定值能力，侵襲力的不同有關(guān)。

表5 慢性阻塞性肺病感染病原菌種類及構(gòu)成比

圖1 痰培養(yǎng)定植菌與致病菌的判斷

研究結(jié)果提示，革蘭陰性桿菌是引起下呼吸道感染的主要致病菌，革蘭陽(yáng)性球菌相對(duì)較少。除了萬(wàn)古霉素沒(méi)有耐藥以外，致病菌對(duì)其他的抗生素均有不同程度耐藥。由于氨芐西林的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌已經(jīng)對(duì)其產(chǎn)生了很高的耐藥性，肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西100%耐藥，不宜作為首選用藥。本試驗(yàn)銅綠假單胞菌對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、氨曲南的耐藥率達(dá)到76.8%～90.2%，臨床中可選擇低耐藥的阿米卡星、亞胺培南和頭孢他啶，革蘭陽(yáng)性球菌整體對(duì)青霉素、苯唑西林，氧氟沙星、紅霉素耐藥率較高，對(duì)萬(wàn)古霉素不耐藥，可作為感染時(shí)選用。對(duì)臨床上常用的抗生素其耐藥率較高，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)該注意聯(lián)合用藥以降低細(xì)菌耐藥的發(fā)生。對(duì)年老體弱，長(zhǎng)期大量使用抗菌藥物治療者，應(yīng)特別警惕，盡早送檢痰培養(yǎng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)報(bào)告，合理選擇抗菌藥物，調(diào)整經(jīng)驗(yàn)用藥，減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生及菌群失調(diào)的產(chǎn)生[4]。

表2 不同質(zhì)量標(biāo)本培養(yǎng)出的細(xì)菌之間定植率和感染率的比較[n(%)]

表3 圖片免疫病理現(xiàn)象與細(xì)菌感染和定植的關(guān)系[n(%)]

表4 不同種類細(xì)菌感染率和定植率之間的比較[n(%)]

表6 主要革蘭陰性桿菌耐藥率

表7 主要革蘭陽(yáng)性球菌耐藥率

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1671-8194（2017）14-0052-03

*通訊作者