T—RFLP指紋圖譜技術(shù)分析細(xì)菌型微生物肥料菌種穩(wěn)定性

魏霜 劉建華 吳西源 黃帥 周陸寧 林春貴 吳希陽 劉中勇

摘要 [目的]建立一種分析微生物肥料菌種穩(wěn)定性的T-RFLP指紋圖譜技術(shù)。[方法]采用T-RFLP指紋圖譜技術(shù)對(duì)進(jìn)口細(xì)菌型微生物肥料菌種的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。[結(jié)果]樣品中優(yōu)勢(shì)菌的T-RFs片段主要是87、246、247、330 bp，其中330 bp為主要片段，Shannon多樣性指數(shù)和均一性指數(shù)測(cè)定結(jié)果表明，不同批次產(chǎn)品間差異性較小，微生物群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。[結(jié)論]建立了微生物肥料菌種穩(wěn)定性分析的T-RFLP指紋圖譜技術(shù)，為進(jìn)出口微生物肥料產(chǎn)品提供了一種快速分析方法。

關(guān)鍵詞 T-RFLP；微生物肥料；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào) S144 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）01-0143-02

TRFLP Analysis for Stability of Bacterial Microbial Fertilizers

WEI Shuang1，LIU Jianhua2，WU Xiyuan3，LIU Zhongyong1* et al

（1.Shantou EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong 515041；2.Standard and Technical Regulation Research Center of AQSIQ，Beijing 100028；3.Guangzhou Airport EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong 510000）

Abstract [Objective] The aim was to establish a TRFLP technique for the stability of bacterial microbial fertilizers.[Method] We used terminal restriction fragment length polymorphism （TRFLP） technique to analyze the stability of import microbial fertilizers.[Result] The TRFs fragments with the sizes of 87，246，247 and 330 bp were the dominant bacteria.The TRFs fragments with the sizes of 330 bp was the most important dominant bacteria.The Shannon diversity index and evenness index show that the diversity between the different batches of products was small.The community of bacterial of products were stability.[Conclusion] A TRFLP technique has been developed for analyze the stability of microbial fertilizers，which can be used for the import or export of microbial fertilizers.

Key words TRFLP；Microbial fertilizers；Stability

化肥的使用使農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)下降，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、適口性降低，蔬菜硝態(tài)氮超標(biāo)、亞硝態(tài)氮積累超標(biāo)；還引起江河湖泊的富營(yíng)養(yǎng)化，破壞土壤結(jié)構(gòu)，致使土壤中有機(jī)質(zhì)減少，保存養(yǎng)分、水分的能力下降，易發(fā)生風(fēng)蝕和荒漠化[1]。微生物肥料是1種或多種功能微生物經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)增殖后直接使用，或者濃縮或經(jīng)載體吸附而制成的活菌制品。它具有多方面的優(yōu)點(diǎn)：土壤團(tuán)?；巴寥栏牧肌⒃黾又参锟鼓婢衬芰?；促進(jìn)分解有機(jī)物質(zhì)；防除病害，減少農(nóng)藥的需求；連續(xù)造肥作用，提供植物吸收，如氮肥制造、達(dá)成肥分的可溶性、提供有機(jī)營(yíng)養(yǎng)等；解除毒素促進(jìn)植物生長(zhǎng)；增進(jìn)肥效[2-3]。微生物肥料不僅可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量，而且還能夠解決因長(zhǎng)期使用化肥而造成的一系列生態(tài)環(huán)境問題，微生物肥料在綠色有機(jī)食品生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境保護(hù)以及高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

當(dāng)進(jìn)出口微生物肥料量較大時(shí)，對(duì)批批產(chǎn)品都按照標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定檢測(cè)流程進(jìn)行檢驗(yàn)檢疫的工作量大，因此，探尋一種快速、自動(dòng)化、準(zhǔn)確的微生物肥料產(chǎn)品篩檢技術(shù)對(duì)該類產(chǎn)品通關(guān)速度的加快具有重要意義。李朔[4]利用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)研究了微生物肥料培養(yǎng)過程中菌群的變化，同時(shí)還分析了微生物肥料施用過程中土壤的生物多樣性變化；李武等[5]利用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)對(duì)同一生產(chǎn)批次3個(gè)不同包裝樣品的細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行分析，建立了對(duì)微生物肥料質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估和檢測(cè)的方法。T-RFLP是建立在PCR、RFLP等技術(shù)和DNA片段分析技術(shù)不斷完善的基礎(chǔ)上，由這些技術(shù)的融合產(chǎn)生的一種全新、快速、有效的微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法。該技術(shù)已被成功應(yīng)用于菌種的鑒定、各種微生物群落的比較分析、微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)特征的研究等方面，是目前很有前景的微生物群落指紋圖譜分析技術(shù)[6-8]。筆者利用微生物肥料中微生物群落的T-RFLP指紋圖譜技術(shù)，分析了微生物肥料產(chǎn)品菌種組成穩(wěn)定性，以便對(duì)大規(guī)模微生物肥料樣品進(jìn)行快速分析。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的樣品為進(jìn)口液體微生物肥料，自廣東汕頭國際集裝箱碼頭分3批進(jìn)口，來源于美國，每批次取3個(gè)樣品，分別是2015年11月（A1、A2、A3）、2016年5月（B1、B2、B3）、2016年7月（C1、C2、C3）進(jìn)口。PCR產(chǎn)物純化試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取。

采用試劑盒法提取樣品基因組DNA，取1 mL樣品，12 000 r/min離心5 min，去除上清液，按照DNA提取試劑盒說明書中的操作步驟進(jìn)行提取，提取出的DNA保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化。

選用細(xì)菌16S rRNA通用引物8F/1492r，8F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492r：ACGGTTACCTTGTTACGACTT，其中8F的5′端進(jìn)行FAM熒光標(biāo)記。反應(yīng)體系包括：10×PCR Buffer緩沖液5.00 μL、dNTPs溶液4.00 μL，各引物終濃度均為0.2 μmol/L，DNA模板2.00 μL、Ex Taq酶0.25 μL，ddH2O調(diào)節(jié)最終體積至50.00 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，后經(jīng)2.0%瓊脂糖電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.2.3 酶切及T-RFs分析。

純化后的PCR產(chǎn)物采用Hha Ⅰ進(jìn)行酶切，方法根據(jù)相應(yīng)內(nèi)切酶的使用說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系：10×M Buffer緩沖液0.50 μL，內(nèi)切酶4.00 μL，PCR產(chǎn)物6.00 μL，ddH2O調(diào)節(jié)最終體積至40.00 μL。在37 ℃下消化6 h，反應(yīng)完成后，Hha Ⅰ 在65°C水浴20 min失活，酶切后的產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因掃描，得到T-RFLP圖譜。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理。

T-RFLP圖譜中數(shù)據(jù)處理，去除小于50 bp或大于500 bp的片段以及峰面積占總峰面積0.5%的片段。核糖核酸豐度指數(shù)（S）相當(dāng)于限制性片段圖譜中差異片段的總數(shù)；Shannon多樣性指數(shù)（H）和均一度指數(shù)（E）根據(jù)Mills等[9]的方法計(jì)算。采用BIO-DAP軟件計(jì)算樣品之間的Jaccard 相似度指數(shù)，用于評(píng)價(jià)2個(gè)樣品微生物群落的相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 T-RFLP數(shù)據(jù)初步分析

根據(jù)T-RFLP掃描結(jié)果統(tǒng)計(jì)T-RFs片段長(zhǎng)度，挑選出片段峰面積占總峰面積比例超過10%作為優(yōu)勢(shì)片段，結(jié)果見表1。9個(gè)樣品T-RFs片段數(shù)量為4～9個(gè)，片段大小集中在64～363 bp，優(yōu)勢(shì)T-RFs片段長(zhǎng)度主要是87、246、247、330 bp，其中330 bp片段所占比例最大，集中在40.63%～74.81%，說明產(chǎn)品中優(yōu)勢(shì)菌株較穩(wěn)定。

2.2 多樣性分析

由表2可知，C批次樣品T-RFs總片段數(shù)大于B批次樣品，B批次樣品T-RFs總片段數(shù)大于A批次樣品，但結(jié)合峰面積比例計(jì)算出的Shannon多樣性指數(shù)和均一性指數(shù)來看，大部分樣品Shannon多樣性指數(shù)集中在10～1.5，均一性指數(shù)集中在0.6～0.9，樣品的微生物多樣性變化不大，產(chǎn)品的微生物群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。

2.3 相似性分析

由表3可知，所有樣品之間Jaccard相似度指數(shù)集中在0.250～0.857，A批次樣品之間Jaccard相似度指數(shù)在0.400～0.750，B批次樣品之間Jaccard相似度指數(shù)在0.400～0.750，C批次樣品之間Jaccard相似度指數(shù)在0625～0.857。

3 結(jié)論

建立了用于細(xì)菌型微生物肥料中微生物群落分析的T-RFLP指紋圖譜技術(shù)。結(jié)果表明，汕頭口岸進(jìn)口的微生物肥料菌株結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，優(yōu)勢(shì)菌種穩(wěn)定且占整個(gè)群落結(jié)構(gòu)的比例較高；該方法快速，在1 d之內(nèi)能得到分析結(jié)果，比傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法更簡(jiǎn)便，可用于進(jìn)出口微生物肥料產(chǎn)品菌落穩(wěn)定性的初篩。

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