食品蛋白磷酸化改性的研究進展

馬慶?！⊥粢患t　劉志東　黃洪亮　曲映紅　劉健　戚亭

摘要 食品蛋白的磷酸化改性是食品蛋白質(zhì)改性的有效方式，能夠改善食品蛋白質(zhì)的功能特性，擴大食品蛋白質(zhì)應(yīng)用領(lǐng)域。綜述了食品蛋白磷酸化改性的研究現(xiàn)狀、存在的問題、改性產(chǎn)物的安全性，并對今后該領(lǐng)域的研究前景進行了展望。

關(guān)鍵詞 食品蛋白；磷酸化改性；功能特性；進展

中圖分類號 TS201.2+1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）01-0099-03

Advances in Phosphorylation Modification of Food Proteins

MA Qingbao1，2， WANG Yihong1， LIU Zhidong1* et al

（1.East China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Shanghai 200090；2. College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Abstract Phosphorylation modification is an effective way to modify food protein， which can improve the functional properties of food protein， expand the field of food protein applications. The research status of food protein phosphorylation modification， existing problems， safety of modified products were reviewed， the prospect of this field was forecasted.

Key words Food protein；Phosphorylation modification；Functional properties；Advance

蛋白質(zhì)是食品重要的組分之一，能夠?qū)κ称焚|(zhì)構(gòu)、品質(zhì)和消費者的接受度產(chǎn)生較大的影響。由于應(yīng)用領(lǐng)域的不同，對于食品蛋白的功能特性要求差異也較大。研究人員為了獲得特定用途的食品蛋白，探索了食品蛋白功能特性的改善研究方法。蛋白質(zhì)改性的目的是改善食品蛋白的功能特性（持水性、持油性、溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性等），減少或消除食品本身含有的抗營養(yǎng)因子等，拓展其應(yīng)用領(lǐng)域[1-3]。

目前，食品蛋白功能特性改善方法主要有物理法、化學法和生物法等。化學法改性主要包括：磷酸化、?；?、去酰胺、羰基化、糖基化及氧化等方法。蛋白質(zhì)的磷酸化改性是通過將磷酸基團引入蛋白質(zhì)基團，改變或影響食品蛋白的結(jié)構(gòu)，從而改變食品蛋白的功能特性。近年來，研究人員以大豆蛋白、乳蛋白、雞蛋清蛋白、酪蛋白等為原料開展了食品蛋白的磷酸化改性研究并取得了積極進展[4-7]。然而，食品蛋白的磷酸化改性仍然存在改性產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)不明確，產(chǎn)物安全性較差等問題。

筆者綜述了食品蛋白磷酸化改性的基本原理、主要方法、影響因素等，以期推動食品蛋白的磷酸化改性研究進展，擴大其應(yīng)用領(lǐng)域。

1 食品蛋白質(zhì)磷酸化改性的方法

1.1 化學法磷酸化改性

化學法磷酸化改性是指采用磷酸基化學物質(zhì)，如三氯氧磷、五氧化磷等用于食品蛋白的化學改性，獲得磷酸化蛋白產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化乳蛋白的乳化性質(zhì)得到顯著改善；酪蛋白和β乳球蛋白與鈣結(jié)合的能力增強。Nayak等[8]采用三氯氧磷對水牛乳蛋白（酪蛋白、沉淀物和乳清蛋白）進行磷酸化處理，結(jié)果表明，乳清蛋白在水溶液、鈉鹽溶液和鈣鹽溶液中的溶解性均明顯提高?；瘜W磷酸化改性具有成本低、操作簡單、應(yīng)用廣的優(yōu)勢，但也存在反應(yīng)條件劇烈，產(chǎn)物中存在化學試劑殘留，反應(yīng)過程存在安全隱患，產(chǎn)物的相關(guān)毒理學信息較少等不足。

1.2 酶解法磷酸化改性

食品蛋白的酶解法磷酸化改性反應(yīng)條件較為溫和，反應(yīng)產(chǎn)物安全性較高。Ross等[9]以大豆分離蛋白為原料，采用蛋白激酶磷酸化改性，改性后的產(chǎn)物起泡性和乳化特性得到明顯改善。金華麗等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采用三聚磷酸鈉磷酸化改性后的花生蛋白的水解度和蛋白提取率都有所提高。金麗麗等[11]采用多聚磷酸鈉對大豆分離蛋白酶解液進行修飾，發(fā)現(xiàn)經(jīng)木瓜蛋白酶水解及磷酸化修飾，大豆分離蛋白在pH 4.5條件下的氮溶解指數(shù)由2.98%提高到6414%。但是酶的專一性強、價格高等因素限制了其在食品蛋白質(zhì)磷酸化改性方面的應(yīng)用。

1.3 物理法磷酸化改性

1.3.1 美拉德反應(yīng)磷酸化改性。

美拉德反應(yīng)磷酸化的原理是蛋白質(zhì)與G6P反應(yīng)生成蛋白質(zhì)-G6P結(jié)合物。Kato等[12]以卵清蛋白為原料進行磷酸化改性，結(jié)果表明，采用G6P磷酸化改性，卵清蛋白的溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性等的功能特性均有顯著改善。該法的不足是反應(yīng)產(chǎn)物會因發(fā)生褐變反應(yīng)而影響食品的感官特性，且6-磷酸葡萄糖較高的價格也影響了其規(guī)?；瘧?yīng)用。

1.3.2 加熱干燥法磷酸化改性。

加熱干燥法磷酸化指食品蛋白在磷酸鹽存在條件下加熱，促使含有羥基的糖、氨基酸、蛋白及糖蛋白能夠發(fā)生磷酸化反應(yīng)。Li等[13]將乳清大豆蛋白與焦磷酸鹽進行磷酸化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)乳清大豆蛋白具有較強的熱穩(wěn)定性、乳化性、起泡性、吸水性和吸油性等。蛋清蛋白經(jīng)過加熱磷酸化法改性后，磷酸化程度提高了1.05%，電泳強度、表面疏水性、起泡性、熱穩(wěn)定性和消化性明顯提高。同時，其凝膠強度增強，持水能力顯著增加，表明加熱干燥法磷酸化能夠改善食品蛋白的功能特性[14-15]。

2 食品蛋白磷酸化改性的原理

食品蛋白磷酸化改性的基本原理是通過磷酸基團與蛋白質(zhì)基團特定氧原子（Ser、Thr、Tyr的-OH）或氮原子（Lys的氨基、His咪唑環(huán)1，3位的N、Arg的肌基末端的N）的結(jié)合形成-C-O-Pi或-C-N-Pi的酯化反應(yīng)。前者在食品的pH（3～7）范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，所以，蛋白的磷酸化改性理論上適用于食品蛋白的改性[16]；后者對酸不穩(wěn)定，在pH<7的環(huán)境下發(fā)生水解。傳統(tǒng)的磷酸化改性多采用化學磷酸化法，其基本機理是磷酸化試劑提供的無機磷與蛋白質(zhì)中的特定氨基酸分子的羥基氧原子或者氮原子發(fā)生反應(yīng)，但是不同的化學磷酸化試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)的部位、反應(yīng)途徑、反應(yīng)產(chǎn)物等均不同。下面列舉化學磷酸化某些常用的試劑簡要說明相關(guān)反應(yīng)機理。

2.1 三氯氧磷

三氯氧磷與水接觸通常發(fā)生放熱反應(yīng)，通過這種放熱反應(yīng)容易導致食品蛋白變性。三氯氧磷通常先溶于四氯化碳或者己烷，再對食品蛋白進行改性，改性時采用氫氧化鈉或者鹽酸保持pH為5和9，反應(yīng)所需溫度較低，通過冰浴進行控制。因為氯離子是活性游離基團，三氯氧磷和2個中間產(chǎn)物[（1）和（2）]活性都很強，磷酸化可以改善蛋白的功能特性，反應(yīng)原理如（3）和（4）[17]所示。

POCl3+H2O→POCl-2（中間物1）+Cl-+2H+ （1）

POCl-2+H2O→PO3Cl-2（中間物2）+Cl-+2H+ （2）

Protein-NH2+POCl3→Protein-NH-POCl2+HCl （3）

Protein-NH-POCl2+HOOC-Protein→Protein-NH-C（=O）-Protein+HOPOCl2 （4）

申世強[18]研究發(fā)現(xiàn)，采用三氯氧磷改性的大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，變性溫度和變性焓均高于未改性的大豆分離蛋白，表明改性后的大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。Hirofum等[19]對β乳球蛋白進行加熱干燥磷酸化研究，也發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性增強。Huang等[20]采用三氯氧磷對酵母蛋白進行磷酸化改性，發(fā)現(xiàn)磷酸化后蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性很高，泡沫穩(wěn)定性增強，且胃蛋白酶和胰液素對磷酸化以后的酵母蛋白抑制作用明顯降低，易被消化吸收。田少君等[21]采用三氯氧磷對大豆分離蛋白進行磷酸化改性，發(fā)現(xiàn)改性后大豆分離蛋白的溶解性、凝膠性得到較大的提高。當?shù)入婞c為pI 3.0左右時，磷酸化分離蛋白溶液的黏度較之前提高。大豆分離蛋白用三聚磷酸鈉改性，乳化性顯著提高。

2.2 環(huán)狀磷酸三鈉

環(huán)狀磷酸三鈉（STMP）是食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）許可的食品添加劑，被視為磷酸化改性的安全試劑，主要是羥氨磷酸酯化和賴氨酸氨基磷酸化，具體反應(yīng)機理[22]見式（5）和（6）。

Ser-OH+STMP→Ser-O-PO2-3+P2O4-7+H+ （5）

Lys-NH2+STMP→Lys-NH-TMP （6）

2.3 三聚磷酸鈉

三聚磷酸鈉（STP）已作為食品添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)（水分保持劑、品質(zhì)改良劑、pH調(diào)節(jié)劑、金屬螯合劑），能夠有效改善食品功能和營養(yǎng)特性且不影響食品蛋白的消化率。毒理學試驗已經(jīng)證實，改性產(chǎn)物是安全的。STP與食品蛋白的反應(yīng)受pH影響較大，酸性條件下，羥基活性較弱；堿性條件下，STP主要與食品蛋白胺基反應(yīng)。研究表明，磷酸根主要連接在氮原子上，實質(zhì)是賴氨酸殘基的氨基磷酸酯化反應(yīng)[23]。Kim等[24]采用三聚磷酸鈉對大豆蛋白進行磷酸化改性研究，發(fā)現(xiàn)改性后的大豆蛋白溶解性、起泡性和持水性都顯著提高，pH為8時蛋白質(zhì)的溶解度卻降低，可能是磷酸化改性蛋白的等電點轉(zhuǎn)變到酸性區(qū)域，結(jié)構(gòu)改變發(fā)生聚合，溶解度降低。

3 食品蛋白磷酸化的影響因素

3.1 蛋白質(zhì)原料

目前，用于磷酸化改性的食品蛋白主要有大豆蛋白、雞蛋清蛋白、乳蛋白、酪蛋白等。申世強[18]對大豆分離蛋白進行磷酸化改性時，發(fā)現(xiàn)磷酸化程度隨底物大豆分離蛋白濃度的增加而增加。Xiong等[25]研究了卵清蛋白的磷酸化，發(fā)現(xiàn)食品蛋白引入的磷酸基團增加了分子間的排斥作用，使粒子半徑減小，提高了卵清蛋白的乳化性能。李珊珊等[26]研究得出，乳蛋白的磷酸化修飾對酪蛋白膠束與磷酸鈣的結(jié)合至關(guān)重要，與牛奶的穩(wěn)定性有關(guān)?？爹i[27]將酪蛋白通過磷酸化改性修飾引入磷酸根基團改變酪蛋白分子的電負性，使其更易分散。不同種類的食品蛋白原料經(jīng)磷酸化改性時，功能特性改變不同，可以選擇性利用蛋白質(zhì)原料的特定功能進行磷酸化改性。

3.2 磷酸化基團

食品蛋白磷酸化也同樣受到磷酸化基團的影響，不同的磷酸化基團對蛋白質(zhì)的作用位點不同，從而影響蛋白的功能特性。核磁共振譜表明，三氯氧磷蛋白磷酸化反應(yīng)的實質(zhì)主要是賴氨酸及精氨酸殘基進行氨基磷酸酯化反應(yīng)。潘秋琴等[28]采用紅外光譜研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸、蘇氨酸和絲氨酸殘基是發(fā)生食品蛋白磷酸化的主要位置。Yamada等[29]采用STMP作為磷酸化試劑對大豆分離蛋白和大豆組織蛋白進行磷酸化改性。研究發(fā)現(xiàn)，STMP只在堿性環(huán)境中起作用，對蛋白質(zhì)的親和能力強。Sung等[30]采用環(huán)狀磷酸三鈉磷酸化大豆蛋白，在pH 11.5、35 ℃、1%環(huán)狀磷酸三鈉條件下，大豆蛋白中30%的絲氨酸殘基被磷酸化，其水溶性、持水能力、乳化能力和發(fā)泡能力等功能性質(zhì)改善且生物效應(yīng)不降低。李陽陽[31]采用多聚磷酸鈉對大豆分離蛋白進行磷酸化改性，發(fā)現(xiàn)在pH 2.0～5.5范圍內(nèi)磷酸化大豆分離蛋白的溶解性提高；磷酸化蛋白的乳化活性明顯增加，但乳狀液的穩(wěn)定性降低；磷酸化大豆分離蛋白的起泡率和泡沫穩(wěn)定性均增大；大豆分離蛋白溶液的黏度隨蛋白濃度的增加呈近似指數(shù)增大，磷酸化大豆分離蛋白溶液的黏度降低。吳磊燕[32]研究發(fā)現(xiàn)，玉米醇溶蛋白引入磷酸根基團，提高了玉米醇溶蛋白的界面活性，且磷酸化程度越高，界面蛋白膜的延伸率也顯著提高，膜柔韌性效果越好，磷酸化改性有效改善膜的柔韌性，適合工業(yè)化應(yīng)用。不同磷酸化試劑對改性蛋白功能特性影響差距較大，可能與其各自的化學結(jié)構(gòu)及磷酸化的氨基酸種類不同有關(guān)。

3.3 鹽離子

Arfat等[33]研究了不同濃度硫酸鋅溶液對鲹魚魚糜（0.25%和0.50%的STPP磷酸化）凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)磷酸化后的魚糜更容易與鋅離子結(jié)合，且可增加魚糜或蛋白質(zhì)的凝膠色度和強度。申世強[18]研究氯化鈉濃度對磷酸化改性蛋白溶解度的影響，結(jié)果表明，磷酸化蛋白的溶解度降低，磷酸化使蛋白分子上的電荷分布發(fā)生了變化，陽離子中和蛋白表面的負電荷，破壞蛋白分子的水合膜，從而使蛋白質(zhì)溶解度降低。研究發(fā)現(xiàn)，體系添加陽離子中和磷酸化后引入的磷酸根陰離子，產(chǎn)生電荷屏蔽效應(yīng)，影響物質(zhì)的功能特性。

3.4 體系的pH

蛋白質(zhì)基團所帶的電荷通過相吸或相斥影響了食品蛋白的功能特性，蛋白基團所帶電荷的種類和多少又受體系pH的影響。Miedzianka等[34]研究體系pH 對馬鈴薯分離蛋白磷酸化的影響，發(fā)現(xiàn)在體系pH 5.2時，改性馬鈴薯分離蛋白氨基酸含量很高，堿性條件下卻降低；體系pH 8.0時，磷酸化馬鈴薯分離蛋白具有較高的吸油性、乳化性和起泡性；然而，其在pH 10.5時才具有較高的吸水性。Sang等[35]采用三聚磷酸鈉磷酸化小麥淀粉，發(fā)現(xiàn)堿性條件下小麥淀粉中單磷酸鹽和二磷酸鹽減少，磷酸化二淀粉磷酸酯卻顯著增加。食品蛋白磷酸化改性殘留的化學物質(zhì)和反應(yīng)產(chǎn)生的毒害物質(zhì)，對機體存在潛在的威脅[36]。因此，改性蛋白若需要作為食品添加劑或食物輔料，需要進行相關(guān)的毒理學試驗。

4 結(jié)論

食品蛋白的磷酸化改性改善了蛋白的功能特性，擴大了蛋白在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，食品蛋白的磷酸化改性研究僅局限于大豆蛋白、花生蛋白等，應(yīng)進一步擴展到其他蛋白。在食品蛋白磷酸化改性機理和方法方面還有待進行深入的研究，磷酸化改性蛋白的營養(yǎng)特性、毒理學研究也是未來研究的重點。

參考文獻

[1] 于莉萍.改性對大豆分離蛋白組分凝膠穩(wěn)定性影響的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2012.

[2] 姚玉靜，楊曉泉，張新會.大豆分離蛋白的磷酸化改性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，27（10）：5-8.

[3] 熊柳，孫高飛，王建化，等.花生分離蛋白磷酸化改性研究[J].食品科學，2010，31（10）：35-41.

[4] 李陽陽，張坤生，任云霞.磷酸化大豆分離蛋白質(zhì)功能特性的研究[J].食品研究與開發(fā)，2005，26（4）：3-5.

[5] BRAND J，SILBERBAUER A，KULOZIK U.Comparison of different mechanical methods for the modification of the egg white protein ovomucin，part A：Physical effects[J].Food and bioprocess technology，2016，9（3）：501-510.

[6] 鄭優(yōu)，賈亮，段蓉，等.響應(yīng)面法優(yōu)化可食性雞蛋清蛋白膜的酶法改性工藝[J].食品工業(yè)科技，2016，37（6）：242-249.

[7] 劉麗莉，向敏，康懷彬，等.雞蛋清蛋白磷酸化改性及功能性質(zhì)的研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（6）：154-158.

[8] NAYAK S K，ARORA S，SINDHU J S，et al.Effect of chemical phosphorylation on solubility of buffalo milk proteins[J].International dairy journal，2006，16（3）：268-273.

[9] ROSS L F，BHATNAGAR D.Enzymatic phosphorylation of soybean proteins[J].Journal of agricultural and food chemistry，1989，37（4）：841-844.

[10] 金華麗，鄭靜靜.磷酸化預(yù)處理對花生蛋白酶解特性的影響[J].河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2015，36（1）：8-11.

[11] 金麗麗，朱秀清，趙興明，等.磷酸化修飾對大豆分離蛋白酶解液溶解性的影響[J].食品工業(yè)，2014，35（8）：98-103.

[12] KATO Y，AOKI T，KATO N，et al.Modification of ovalbumin with glucose 6phosphate by Aminocarbonyl reaction.Improvement of protein heat stability and emulsifying activity[J].Journal of agricultural and food chemistry，1995，43（2）：301-305.

[13] LI C P，CHEN D Y，PENG J L，et al.Improvement of functional properties of whey soy protein phosphorylated by dryheating in the presence of pyrophosphate[J].LWTfood science and technology，2010，43（6）：919-925.

[14] LI C P，IBRAHIM H R，SUGIMOTO Y，et al.Improvement of functional properties of egg white protein through phosphorylation by dryheating in the presence of pyrophosphate[J].Journal of agricultural and food chemistry，2004，52（18）：5752-5758.

[15] 趙卉雙，陳麗嬌，梁鵬，等.不同改性方法對蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響研究[J].食品工業(yè)，2015，36（12）：223-225.

[16] 李林.蛋白質(zhì)磷酸化作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[J].生物化學與生物物理進展，1997，24（4）：290-295.

[17] MATHEIS G.Phosphorylation of food proteins with phosphorus oxychlorideimprovement of functional and nutritional properties：A review[J] Food chemistry，1991，39（1）：13-26.

[18] 申世強.磷酸化和琥珀?；蠖狗蛛x蛋白的制備與功能性質(zhì)研究[D].廣州：暨南大學，2010.

[19] ENOMOTO H，LI C P，MORIZANE K，et al.Glycation and phosphorylation of betalactoglobulin by dryheating：Effect on protein structure and some properties[J].Journal of agriculture and food chemistry，2007，55（6）：2392-2398.

[20] HUANG Y T，KINSELLA J E.Effects of phosphorylation on emulsifying and foaming properties and digestibility of yeast protein[J].Journal of food science，1987，52（6）：1684-1688.

[21] 田少君，李小陽，曾艷菊，等.大豆分離蛋白的磷酸化改性[J].中國糧油學報，2003，18（2）：46-49.

[22] WANG Y C，WANG S S，WANG J F，et al.Preparation and antiosteoporotic activities in vivo of phosphorylated peptides from Antarctic krill（Euphausia superba）[J].Peptides，2015，68：239-245.

[23] 藺丹華.磷酸化處理對酪蛋白酶解特性的影響[D].鄭州：河南工業(yè)大學，2014：10-22.

[24] KIM N S，KWON D Y，NAM Y J.Effects of phosphorylation and acetylation on functional properties and structure of soy protein[J].Journal of food science and technology，1988，20（5）：625-630.

[25] XIONG Z Y，ZHANG M J，MA M H.Emulsifying properties of ovalbumin：Improvement and mechanism by phosphorylation in the presence of sodium tripolyphosphate[J].Food hydrocolloids，2016，60：29-37.

[26] 李珊珊，王加啟，魏宏陽，等.乳蛋白磷酸化分析方法研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2010，41（1）：149-152.

[27] 康鵬.酪蛋白的磷酸化及功能性質(zhì)研究[D].天津：天津商業(yè)大學，2008：5-48.

[28] 潘秋琴，沈蓓英，程霜.花生蛋白質(zhì)的磷酸化改性[J].中國油脂，1997，22（l）：25-27.

[29] YAMADA E A，SGARBIERI V C.Yeast（Saccharomyces cerevisiae）protein concentrate：Preparation，chemical composition and nutritional，and functional properties[J].Journal of agricultural and food chemistry，2005，53（10）：3931-3936.

[30] SUNG H Y，CHEN H J，LIU T Y，et al.Improvement of the functionalities of soy protein isolate through chemical phosphorylation[J].Journal of food science，2006，48（3）：716-721.

[31] 李陽陽.大豆分離蛋白磷酸化及功能性質(zhì)研究[D].天津：天津商學院，2006：3-47.

[32] 吳磊燕.玉米醇溶蛋白改性、界面特性及成膜性研究[D].上海：華東理工大學，2010：29-125.

[33] ARFAT Y A，BENJAKUL S.Effect of zinc sulphate on gelling properties of phosphorylated protein isolate from yellow stripe trevally[J].Food chemistry，2013，141（3）：2848-2857.

[34] MIEDZIANKA J，PE KSA A.Effect of pH on phosphorylation of potato protein isolate[J].Food chemistry，2013，138（4）：2321-2326.

[35] SANG Y J，PAULA S，ALVAROL H，et al.Effects of alkaline treatment on the structure of phosphorylated wheat starch and its digestibility[J].Food chemistry，2010，118（2）：323-327.

[36] 胡磊.大豆?jié)饪s蛋白的改性及其在肉制品的應(yīng)用研究[D].上海：華南理工大學，2013：45-65.