蒸蛋糕中微生物菌群結構鑒定及其抑制方法的探究

何艷霞 王鳳 楊文丹

摘要 [目的]研究蒸蛋糕在貯藏過程中的微生物變化，探索延長其保質(zhì)期的方法。[方法]采用基因測序的方法對蒸蛋糕貯藏過程中的微生物多樣性和主要微生物菌群進行了分析，并研究了脫氫乙酸鈉、丙酸鈣和山梨酸鉀3種防腐劑對蒸蛋糕保質(zhì)期的影響。[結果]蒸蛋糕在貯藏過程中主要的腐敗是表皮霉變，在蒸蛋糕的貯藏過程中主要的細菌為Staphylococcus和Kocuria；主要的霉菌為Penicillium、Cladosporium和Aspergillus；3種防腐劑都可以抑制微生物的繁殖速度，防霉變的能力大小依次為脫氫乙酸鈉、丙酸鈣、山梨酸鉀。[結論]研究可為延長蒸蛋糕的保質(zhì)期提供理論依據(jù)和技術參考。

關鍵詞 蒸蛋糕；防腐保鮮；微生物菌群；分子生物學分析

中圖分類號 TS201.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）18-0091-06

Abstract [Objective] The changes of microorganism were investigated for steamed cakes during storage， the method to extend the shelf life was explored.[Method] The diversitiy and major strains of microbial community were analyzed using gene sequencing biological methodolodgy， and the effects of three kinds of antiseptic on shelf life of steamed cake， such as dehydrogenation sodium acetate， calcium propionate and potassium sorbate， were studied.[Result] The spoilage of steamed cake mainly occurred in skin or outer surface of steamed cake product.The main strains of bacteria were found to be Staphylococcus and Kocuria.The main mold strains included Penicillium， Cladosporiumand， and Aspergillus， which were found to be predominate in steamed cake during storage.Three kinds of preservatives used could extend the shelf life of steamed cake， and the effect of dehydrogenation sodium acetic acid was best， then propionic acid calcium， potassium sorbate had the least effect.[Conclusion] This research can provide theoretical basis and technical reference for extending the shelf life of steamed cake.

Key words Steamed cake；Preservation；Microbial colony；Molecular biological analysis

蛋糕是一種傳統(tǒng)的西點，其質(zhì)地柔軟、富有彈性、具濃郁香味、易消化，深受消費者的喜愛 [1]。隨著人們生活水平的提高，消費市場對蛋糕提出了更高的要求，因此蛋糕的研究在國內(nèi)外也已成熱點，且主要集中在蛋糕配方[2-6]、品質(zhì)[7-9]和保質(zhì)期[9-12]等方面。

為了滿足消費者的需求，近年來在我國市場上出現(xiàn)了具有我國傳統(tǒng)特色的蛋糕——蒸蛋糕，因其組織細膩、彈性好、口感綿軟、入口即化且采用蒸制工藝，所以廣受現(xiàn)代人的追捧。但是蒸蛋糕含水量高達28%～30%，幾乎是烤制蛋糕的2倍[13]，是糕點中最難貯存的品種之一，因此蒸蛋糕的防霉保鮮值得重視和深入研究。目前，國內(nèi)外對于蒸蛋糕領域的研究報道極少[13-14]，對蒸蛋糕的微生物菌群進行分析，提高蒸蛋糕安全性的研究還鮮見報道。

筆者通過PCR分子生物學的方法探索蒸蛋糕中微生物的生長及菌群變化，通過添加丙酸鈣、山梨酸鉀和脫氫乙酸鈉，尋找最適合蒸蛋糕防腐保鮮的添加劑，從而為蒸蛋糕保質(zhì)期的研究提供理論依據(jù)，延長蒸蛋糕的保質(zhì)期。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料與主要試劑。

低筋粉，江蘇省南順食品有限公司；白砂糖和奶粉，福臨門食品有限公司；雞蛋和鹽，均為市售食品級；植物油，金龍魚葵花籽油；菱友TM MFC-68，三菱化學食品有限公司；糖醇和丙三醇，珠海市宏泰生物科技有限公司；泡打粉，焙樂道公司；丙酸鈣、山梨酸鉀和脫氫乙酸鈉，泰州市榮昌食品添加劑有限公司；菌落總數(shù)計數(shù)培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、甘油、無水乙醇、異丙醇、瓊脂、氯化鈉、瓊脂糖，國藥集團化學有限公司；快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)、PCR試劑，天根生化科技（北京）有限公司；16S rDNA的通用引物27F和1492R、2616S rDNA的通用引物NL1A和NL4B，上海桑尼公司合成。

1.1.2 主要儀器設備。

KitchenAid 打蛋器；美的中式電蒸鍋；SM-25攪拌機；蘇州安泰凈化工作臺SW-CJ-2F，蘇州安泰凈化公司；APX-150C型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JY20002型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；NanoDrop2000分光度計、Legend Micro17型離心機，Thermo公司；PCR儀（T100 Thermal Cycler）、Power pac核酸電泳儀、Geldoc 2000凝膠成像儀，Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 蒸蛋糕的制作。根據(jù)表1中的配方準確稱取各種原料，首先將除低筋粉、奶粉和植物油的所有原料攪拌均勻，然后加入低筋粉和奶粉高速打發(fā)，最后加入植物油攪拌均勻。將攪拌好的面糊分裝到模具中在蒸鍋中蒸熟即可。室溫冷卻2 h后裝入塑封袋中，放置在恒溫保濕箱中（溫度30 ℃，濕度70%）貯藏待用[15]。

1.2.2 菌落總數(shù)和霉菌計數(shù)。

菌落總數(shù)的測定按GBT4789.2—2010《食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[16]。

無菌操作下取25 g蒸蛋糕，加入225 mL無菌水中，振蕩器振蕩30 min，再取1 mL稀釋液加入9 mL無菌水中，依次稀釋成10-1、10-2、10-3倍稀釋液，分別取0.1 mL稀釋液接種到菌落總數(shù)培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，每個處理3次重復，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)并挑取不同形態(tài)的單菌落。無菌操作下取不同形態(tài)的細菌單菌落于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線純化[17]，純化后的單菌落用于顯微鏡鏡檢和分子鑒定。

依據(jù)GB7099—2003《糕點、面包衛(wèi)生標準》，對于熱加工蛋糕，菌落總數(shù)≤1 500 CFU/g[18]。

霉菌的計數(shù)按GBT4789.15—2010《食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)》[19]。

無菌操作下取25 g蒸蛋糕，加入225 mL無菌水中，振蕩器振蕩30 min，再取1 mL稀釋液加入9 mL無菌水中，依次稀釋成10-1、10-2、10-3倍稀釋液，分別取0.1 mL稀釋液接種到YPD和孟加拉紅培養(yǎng)基上，每個處理3 次重復，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5 d，計數(shù)并挑取不同形態(tài)的單菌落。無菌操作下取不同形態(tài)的真菌單菌落于YPD和孟加拉紅培養(yǎng)基上劃線純化[20]，純化后的單菌落用于顯微鏡鏡檢和分子鑒定。

依據(jù)GB7099—2003《糕點、面包衛(wèi)生標準》，對于熱加工蛋糕，霉菌總數(shù)≤100 CFU/g[18]。

1.2.3 菌株的分離、純化和保藏。

根據(jù)菌落形態(tài)和鏡檢結果，挑選出的不同形態(tài)的純單菌落，接種到相應的液體培養(yǎng)基中，先在28 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h后，再與60%的甘油以1∶1進行保存，放置于-80 ℃的冰箱中保藏[20]。

1.2.4 菌株的鑒定。

1.2.4.1 細菌的鑒定。

將之前保存的菌株進行活化，經(jīng)過24 h的活化后，取 5 μL上述菌液作為PCR擴增的模板，反應體系為50 μL：5 μL 10×Buffer（含 Mg2+ ），4 μL dNTPs，0.5 μL Easy Taq DNA酶（2.5 U/μL），引物 27F 、1492R（序列詳見表2）各1 μL，ddH2O補足至50 μL。

細菌 16S rRNA基因擴增條件為 95 ℃預變性 3 min 后進入 30 個循環(huán)：95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，72 ℃延伸 5 min，12 ℃ 5 min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測上述得到 PCR產(chǎn)物的純度。純度達到要求的 PCR擴增產(chǎn)物寄至測序公司測序。 然后采用DNAstar軟件對得到的序列進行拼接，將拼接好的序列與 GenBank中已知 16S rRNA序列進行同源性比對，同源性達到99%及以上的菌株可直接鑒定至種。

根據(jù)試驗所得的比對結果，將相應菌株的模式菌株的序列下載，然后用MEGA 5.05軟件構建分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，對分離出的細菌與模式菌株的親緣關系進行分析。

1.2.4.2 真菌的鑒定。

真菌采用玻璃珠法破壁[21]，并用真菌基因組試劑盒提取分離自蒸蛋糕中的酵母菌和霉菌DNA。用微量紫外分光光度計檢測上述真菌的DNA原液的OD比值（A260 nm/A280 nm）及濃度，將合格者的DNA原液于-20 ℃保存待用。

取200～500 ng/μL上述真菌DNA原液作為PCR擴增的模板，反應體系為 50.0 μL：5.0 μL 10×Buffer（含 Mg2+ ），4.0 μL dNTPs，0.5 μL Easy Taq DNA酶（2.5 U/μL），引物NL1A、NL4B（序列詳見表 2）各1.5 μL，ddH2O補足至50.0 μL。

真菌26S rDNA基因擴增條件為 94 ℃預變性 1 min 后進入 30 個循環(huán)：94 ℃ 1min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，72 ℃延伸 7 min，12 ℃保持5 min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測上述得到PCR產(chǎn)物的純度，純度達到要求的PCR擴增產(chǎn)物寄至測序公司測序。然后采用DNAstar軟件對得到的序列進行拼接，將拼接好的序列與GenBank中已知序列進行同源性比對，同源性達到 99%及以上的菌株可直接鑒定至種。

根據(jù)試驗所得的比對結果，將相應菌株的模式菌株的序列下載，然后用MEGA 5.05軟件構建分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹[22]，對分離出的細菌與模式菌株的親緣關系進行分析。

1.2.5 防腐劑對蒸蛋糕的影響。

蒸蛋糕的制作如前所述，丙酸鈣按照推薦使用量2.5 g/kg進行添加；脫氫乙酸鈉按照推薦使用量0.5 g/kg進行添加；山梨酸鉀按照推薦使用量1.0 g/kg進行添加，添加量都以低筋粉的量計算。添加方法是在調(diào)制面糊時，將添加劑直接添加到面粉中[23]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、MEGA 5.05軟件和DNAstar軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 蒸蛋糕貯藏過程中的微生物變化

在不添加防腐劑的情況下，蒸蛋糕貯藏過程中微生物的變化見表3。

從表3的數(shù)據(jù)分析可知，蒸蛋糕采用保鮮袋密封包裝，在溫度為30 ℃、濕度為70%條件下貯存時，蒸蛋糕的細菌數(shù)目和霉菌數(shù)目呈快速增長趨勢，蒸蛋糕的細菌數(shù)目貯存第3天測定為25 700 CFU/g，超過GB7099—2003 中規(guī)定的熱加工食品時細菌計數(shù)（<1 500 CFU/g）的標準；霉菌計數(shù)為100 CFU/g，達到GB7099—2003中規(guī)定的熱加工食品時霉菌計數(shù)（≤100 CFU/g）的標準上限，蛋糕表面有霉點出現(xiàn)，但是蒸蛋糕內(nèi)部并無霉菌或菌絲出現(xiàn)。由此可知，蒸蛋糕的主要腐敗是發(fā)生在表皮，且以發(fā)霉變質(zhì)為主。這與丘德生[24]報道的糕點中主要腐敗是發(fā)霉變質(zhì)的結果一致。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 細菌的鑒定。

將分離的細菌進行16S rDNA特異性擴增，擴增所用引物為27F、1492R，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，檢測的部分結果見圖1。由圖1可見，泳道約1 500 bp的位置均出現(xiàn)1條亮帶，且無彌散、拖尾和非特異性現(xiàn)象，符合下一步的測序要求。

將符合要求的擴增產(chǎn)物寄往測序公司進行測序，將測序結果拼接后，與基因庫中序列進行同源性對比，對比得到與待測菌株同源性最為接近的已知種屬的序列，同源性達到99%及以上的菌株可直接鑒定至種。其對比結果見表4。

由表4的數(shù)據(jù)分析可知，從蒸蛋糕中總共分離出7種細菌，依次為Staphylococcus warneri、Staphylococcus epidermidis、 Staphylococcus haemolyticus、Kocuriarhizophila、Bacillus tequilensis、Lactobacillus plantarum和Gluconobacter japonicas。其中Staphylococcus warneri和Staphylococcus epidermidis是蒸蛋糕在貯藏過程中的優(yōu)勢菌群，Kocuriarhizophila 次之，其他的幾種菌株都非常少。在蒸蛋糕的貯藏過程中，剛開始的優(yōu)勢細菌是Staphylococcus warneri和Staphylococcus epidermidis，后期主要的細菌為Kocuriarhizophila，這與Ji等[25]對米糕的微生物特性的研究中，米糕在貯藏過程中剛開始的優(yōu)勢菌群是球菌，而后轉(zhuǎn)化為桿菌的研究結果相一致。

根據(jù) NCBI同源性比對結果，下載相應模式菌株的序列，從每個分離自蒸蛋糕的菌種中隨機選取1株，用軟件MEGA 5.05構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 2），對分離菌株和模式菌株之間的親緣關系進行研究 。

從圖2中的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出共檢測到5個屬：Staphylococcus、Kocuria、Bacillus、Gluconobacter和Lactobacillus。因此，Y9、Y10、Y11、Y13、B7、B8、B9、B16、W、Y和B21形成了第1個類群；Y3、B2和Y5各單獨形成一個類群；Y2、B14、B15、B17和B22形成了一個類群。以上分離菌株與相對應的模式菌都聚在一起，且同源性都在 99%以上，說明細菌 16S rRNA 基因序列分析結果具有非常高的可信性 。

2.2.2 真菌的鑒定。

將分離的酵母菌和霉菌進行26S rDNA特異性擴增，擴增所用引物為NL1A、NL4B，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，檢測的部分結果見圖3。由圖3可見，泳道約600 bp的位置均出現(xiàn)1條亮帶，且無彌散、拖尾和非特異性現(xiàn)象，符合下一步的測序要求。

將符合要求的擴增產(chǎn)物寄往測序公司進行測序，將測序結果拼接后，與基因庫中序列進行同源性對比，對比得到與待測菌株同源性最為接近的已知種屬的序列，同源性達到99%及以上的菌株可直接鑒定至種。其對比結果見表5。

由表5數(shù)據(jù)分析可知，從蒸蛋糕中總共分離出11種真菌：1種酵母，為Saccharomyces cerevisiae；10種霉菌，依次為Penicilliumcorylophilum、Penicilliumchrysogenum、Penicilliumbrevicompactum、Penicilliumoxalicum strain、Alternariaalternata、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Cladosporiumsphaerospermum、Aspergillus sydowii和Aspergillus versicolor。其中Penicillium和Aspergillus是蒸蛋糕在貯藏過程中的優(yōu)勢菌群。Legan等[26]發(fā)現(xiàn)，面包中的霉菌主要有Aspergillus、Eurotium、Penicillium、Cladosporium；Baek等[27]發(fā)現(xiàn)，Cladosporium、Neurospora和Penicillium是烘焙和米制品中的主要霉菌，這與筆者研究的結果基本吻合，說明烘焙食品中的主要腐敗霉菌是大致相同的。Ji等[25]報道，P.citreoviride和P.citrinum是我國傳統(tǒng)的米糕中主要的霉菌；Ryan 等[28]發(fā)現(xiàn)，青霉是面包霉變的主要霉菌。這些都與該試驗的研究結果相一致，說明糕點類食品的主要霉變霉菌為青霉屬。

根據(jù) NCBI同源性比對結果，下載相應模式菌株的序列，從每個分離自蒸蛋糕的菌種中隨機選取1株，用軟件MEGA 5.05構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4、5），對分離菌株和模式菌株之間的親緣關系進行研究。

從圖4中的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，共檢測到1個屬：Saccharomyces cerevisiae，因此Y6和Y18形成了一個類群。以上分離菌株與相對應的模式菌都聚在一起，且同源性都在 99% 以上，說明真菌26S rDNA 基因序列分析結果具有非常高的可信性 。

從圖5中的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，共檢測到4個屬：Penicillium、 Alternaria、Aspergillus和Cladosporium。因此，D、SG和S6形成了一個類群；Y、S6、S17和H形成一個類群；B單獨形成一個類群；S01和XH形成了一個類群；S3單獨形成一個類群。以上分離菌株與相對應的模式菌都聚在一起，且同源性都在 99%以上，說明真菌26S rDNA 基因序列分析結果具有非常高的可信性。

2.3 防腐劑對蒸蛋糕的影響

2.3.1 細菌數(shù)的變化。

從表6的數(shù)據(jù)分析可知，第3天時空白和添加防腐劑的蒸蛋糕的菌落總數(shù)雖都已超過GB7099—2003 中規(guī)定的熱加工食品時細菌計數(shù)（<1 500 CFU/g）的標準，但添加防腐劑的蒸蛋糕的細菌數(shù)都小于空白，說明防腐劑可以抑制蒸蛋糕中微生物的生長。第5天時添加防腐劑的蒸蛋糕的細菌數(shù)均大于空白，原因可能是由于空白的蒸蛋糕的霉菌的生長抑制了細菌的生長。

2.3.2 霉菌數(shù)的變化。

從表7的數(shù)據(jù)分析可知，添加防腐劑的蒸蛋糕的霉菌數(shù)都小于空白。第3天時空白的霉菌數(shù)超過GB7099—2003中規(guī)定的熱加工食品時霉菌計數(shù)（≤100 CFU/g）的標準，而添加防腐劑的蒸蛋糕的霉菌均小于國標值。由此可見，3種防腐劑對蒸蛋糕的霉菌都有抑制作用，且3種防腐劑對蒸蛋糕霉變的影響大小依次為脫氫乙酸鈉、丙酸鈣、山梨酸鉀。說明脫氫乙酸鈉對蒸蛋糕的防霉變效果最好，這與林真等[29]對千層蛋糕的研究結果相一致。

3 結論

（1）該研究結果表明，蒸蛋糕主要是由于表皮霉變造成腐敗的，初期主要的腐敗霉菌是青霉菌和球孢枝孢，后期主要的腐敗霉菌是黑曲霉和黃曲霉。

（2）應用分子測序技術對蒸蛋糕中的腐敗微生物構成進行了初步分析，從蒸蛋糕中總共分析到細菌7種，真菌11種。

（3）分析結果表明，Staphylococcus和Kocuriarhizophila是蒸蛋糕腐敗中的優(yōu)勢細菌，Penicillium、Aspergillus和Cladosporium是蒸蛋糕腐敗中的優(yōu)勢霉菌。

（4）研究結果表明，脫氫乙酸鈉對蒸蛋糕的防霉效果優(yōu)于丙酸鈣和山梨酸鉀。

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