洱海流域畜禽飼料·糞便·土壤中四環(huán)素類抗生素殘留分析

王良 劉思路 代光勝

摘要 [目的]研究洱海流域畜禽糞便、飼料和土壤中的四環(huán)素類抗生素殘留狀況。[方法]以云南省洱海流域養(yǎng)殖業(yè)鏈為研究對象，采樣分析了11個飼料樣品、10個糞便樣品、21個土壤樣品中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留狀況。[結(jié)果]飼料中四環(huán)素、土霉素、金霉素的檢出率分別為100%、100%、50%，其中豬飼料中土霉素、金霉素含量最高，其次是雞飼料，奶牛飼料添加的抗生素相對較低；糞樣中土霉素檢出率為100%，四環(huán)素檢出率為80%，金霉素檢出率為90%，其中雞糞中殘留的抗生素最高；土壤抗生素殘留較低，金霉素的檢出率為66.6%，四環(huán)素、土霉素均未檢出。[結(jié)論]洱海流域養(yǎng)殖業(yè)殘留抗生素對環(huán)境和人體健康的風(fēng)險較低。

關(guān)鍵詞 洱海流域；畜禽糞便；土壤；四環(huán)素類抗生素；抗生素殘留

中圖分類號 X53 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）18-0070-03

Abstract [Objective]To study the status of residue of tetracyclines antibiotics in livestock manures，feed and soil in ErhaiLake Basin.[Method]Taking the breeding industry chain as a case，some samples were collected in Erhai Lake in Yunnan Province，including 11 samples of feed，10 samples of livestock and poultry manures，21 samples of soil.The residue of oxytetracycline，tetracycline，and chlortetracycline were analyzed.[Result]The results showed that the detection rate of tetracycline，oxytetracycline and chlortetracycline were 100%，100%，50% in the feed.The contents of oxytetracycline and chlortetracycline in pig feeds were the highest.The contents in chicken feeds and dairy cattle feeds were relatively low.In the samples of livestock and poultry manures，the detection rate of oxytetracycline was 100%，the detection rate of tetracycline was 80%，while the detection rate of chlortetracycline was 90%.The residue of the antibiotics in chicken manures was the highest and the residue of the antibiotics in soil was relatively low.The detection rate of the chlortetracycline was 66.6%，the oxytetracycline and tetracycline were not detected in chicken manures.[Conclusion]This research indicated there is a lower risk of antibiotic conta mination in ErhaiLake Basin.

Key words ErhaiLake Basin；Livestock and poultry manure；Soil；Tetracyclines antibiotics；The residues of antibiotics

抗生素被廣泛應(yīng)用于治療人類疾病、畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及食品加工等方面，其中50% 以上的抗生素用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]，其不僅能預(yù)防與治療疾病，同時具有促進(jìn)動物生長、提高飼料利用效率的作用[2]。隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，抗生素的用量日益增多，我國己成為獸用抗生素的生產(chǎn)與使用大國[3]。

許多獸用抗生素難以被動物腸胃吸收，通常大部分抗生素以藥物原形或其代謝物隨糞尿排出，其中30%～90%以母體化合物的形態(tài)排出[4-5]，部分抗生素可被畜禽吸收后形成代謝產(chǎn)物，但有的代謝物仍然具有生物活性，且隨糞便排出后還可轉(zhuǎn)化為母體形態(tài)[6]，使得動物糞便中抗生素含量普遍較高，并隨畜禽糞尿的土地利用等途徑而進(jìn)入環(huán)境，成為環(huán)境中抗生素的重要來源[3，7]。其中四環(huán)素是我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)中使用量最大的抗生素[3]。

抗生素及其降解產(chǎn)物的環(huán)境效應(yīng)主要表現(xiàn)在2個方面，一是通過影響環(huán)境中各種微生物的種群數(shù)量和其他生物（如水生生物、植物、動物等） 的種群結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)轉(zhuǎn)移方式，破壞以食物鏈為聯(lián)系的生態(tài)系統(tǒng)平衡[8]，并在食物鏈生物中蓄積，沿食物鏈傳遞進(jìn)入人體；二是由于抗生素的大量頻繁使用及殘留，誘導(dǎo)產(chǎn)生了具有忍耐性的抗性菌株，環(huán)境致病菌耐藥性的增加和擴(kuò)散，因此，形成了一類新的環(huán)境污染物-抗生素抗性基因?？股乜剐曰蚓哂泻芨叩倪w移性和活性，會對人類的公共健康構(gòu)成潛在威脅[8-9]。因此，近年來，由抗生素引起的細(xì)菌抗藥性問題引起人們關(guān)注，已成為研究熱點(diǎn)。

畜禽糞便作為有機(jī)肥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，糞便中殘留的抗生素類物質(zhì)也隨著畜禽糞便的利用而進(jìn)入土壤，反復(fù)使用糞肥的土壤中四環(huán)素類抗生素具有一定的持久性[10]，因此，四環(huán)素類抗生素可能在長期使用有機(jī)肥的土壤中累積。

洱海流域位于大理白族自治州，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，洱海流域已成為云南重要的奶牛養(yǎng)殖基地，畜禽糞便年產(chǎn)出量可達(dá)200萬t，但由于畜禽糞便資源無害化利用技術(shù)相對滯后，大量畜禽糞便經(jīng)傳統(tǒng)的農(nóng)田土壤就地利用[11]。大量的獸用抗生素隨畜禽糞便進(jìn)入土壤環(huán)境，可能對洱海流域土壤環(huán)境造成污染，進(jìn)而對當(dāng)?shù)鼐用竦慕】禈?gòu)成潛在威脅。但目前有關(guān)洱海流域畜禽糞便及土壤中有關(guān)抗生素的研究鮮見報道，抗生素的潛在威脅尚未得到足夠的重視。筆者以在畜禽養(yǎng)殖中應(yīng)用最為廣泛的四環(huán)素類抗生素為例，分析四環(huán)素類抗生素在糞便-土壤的殘留狀況，對于評價其生態(tài)風(fēng)險、制訂相應(yīng)的污染防治措施有著重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 四環(huán)素（1 mg相當(dāng)于969單位）、金霉素（94.1%）和土霉素（88.8%）標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院，乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、草酸、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純。

Themo高效液相色譜儀（U3000，賽默飛世爾），高效液相色譜柱（C18 5μm 120 4.6×150㎜），高速冷凍離心機(jī)（12 000 r/min）、超聲波清洗機(jī)等。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取標(biāo)準(zhǔn)品土霉素10 mg、四環(huán)素10 mg、金霉素20 mg溶于100 mL甲醇中配成混合標(biāo)準(zhǔn)液，于4 ℃保存。使用時用甲醇稀釋為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，用甲醇將金霉素稀釋為0.2、1.0、2.0、10.0、20.0、40.0 mg/L。

1.2 樣品采集

以洱海流域不同類型的養(yǎng)殖場作為研究對象，飼料采集包括7種奶?；旌巷暳?、1種雞飼料、2種豬飼料、1種肉牛場的混合飼料；糞便采集包括2個養(yǎng)雞場采樣點(diǎn)、3個奶牛場采樣點(diǎn)、2家養(yǎng)奶牛的農(nóng)戶家采樣點(diǎn)、2個肉牛養(yǎng)殖場采樣點(diǎn)和1個豬場采樣點(diǎn)；土壤采樣點(diǎn)包括施用畜禽糞便的玉米、蔬菜、葡萄等種植地的0～20 cm表層土。所有樣品密封后于-18 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品預(yù)處理

稱取1.00 g新鮮土樣（飼料、糞樣）于10 mL試管中，加入3 mL EDTA-Mcllvaine緩沖提取液（0.05 mol/L EDTA+0.06 mol/L Na2HPO4+0.08 mol/L檸檬酸，pH=4±0.05），振蕩1 min后超聲提取10 min，并以10 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管，再重復(fù)提取2次，合并3次提取液，加入10%三氯乙酸0.5 mL，靜置4 h，再次以10 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入另一試管中待用。

HLB小柱先用3 mL甲醇和3 mL蒸餾水活化，流速約2 mL/min，然后將以上提取液過柱，再用5 mL蒸餾水沖洗HLB小柱，再用3 mL 0.01 mol/L草酸甲醇溶液洗脫抗生素，洗脫液在60 ℃條件下水浴加熱濃縮至2 mL左右，最后用草酸、乙腈和甲醇混合流動相溶液定容至5 mL待測[12]。

1.4 樣品測定 將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品依次加入進(jìn)樣瓶中，用高效液相色譜儀（帶自動進(jìn)樣器）測定，色譜條件：流動相流速1 mL/min，檢測波長355 nm，恒溫25 ℃，進(jìn)樣量為25 μL[13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用高效液相色譜儀自帶的“變色龍”軟件及Excel 2010處理數(shù)據(jù)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中四環(huán)素、土霉素、金霉素含量

通過對雞飼料、牛飼料、豬飼料樣品分析發(fā)現(xiàn)（圖1～3），飼料中四環(huán)素、土霉素、金霉素的檢出率分別為100%、100%、50%；其中豬飼料中土霉素、金霉素含量最高，明顯高于雞飼料和牛飼料，特別是豬飼料（2）中，土霉素、四環(huán)素和金霉素含量均最高；雞飼料中，金霉素含量較低，四環(huán)素含量明顯高于牛飼料，低于豬飼料；在牛飼料中，3種四環(huán)素類抗生素含量均較低，且多數(shù)牛飼料均未檢出金霉素。說明該地區(qū)的畜禽飼料中豬飼料添加的抗生素較多，而奶牛飼料添加的抗生素相對較低，且添加的抗生素種類也存在較大差異。

2.2 糞便中四環(huán)素、土霉素、金霉素含量 從圖4～6可見，在所取糞樣中土霉素檢出率為100%，雞糞中，土霉素含量較高，其中雞糞（2）高達(dá)418.31 mg/kg，奶牛糞（4）中土霉素含量達(dá)123.13 mg/kg；胡獻(xiàn)剛等[14]研究表明，天津畜禽養(yǎng)殖基地糞樣中土霉素最高含量達(dá)到173.2 mg/kg，而該研究中雞糞中土霉素最高含量是其2.5倍。四環(huán)素檢出率為80%，所有糞便樣品中雞糞（2）含量最高，其次是肉牛糞和豬糞樣品，而奶牛糞樣品中四環(huán)素含量相對較低。金霉素檢出率為90%，糞便樣品金霉素含量在0.60～1.20 mg/kg。而在有的集約化養(yǎng)殖場的豬、雞糞便中金霉素檢出率達(dá)到78%，最高殘留值達(dá)到563.80 mg/kg；四環(huán)素和土霉素檢出率也高達(dá)56%，最高值分別達(dá)到34.80和22.70 mg/kg[15]。這可能與各地區(qū)不同抗生素的施用量有關(guān)。

同時發(fā)現(xiàn)奶牛飼料中有5個樣品未檢出金霉素，但對應(yīng)的奶牛糞便中卻檢出較高的金霉素，是否奶牛還有其他抗生素攝入途徑，需要進(jìn)一步調(diào)查研究。

2.3 土壤中四環(huán)素、土霉素、金霉素含量

由表1可知，在21個土樣中，所有樣品均未檢出土霉素和四環(huán)素，在鄧川玉米地（3）采樣點(diǎn)（施加了有機(jī)肥），土壤金霉素含量最高，達(dá)5.52 mg/kg，其中有7個土樣未檢出金霉素，其他14個土樣金霉素含量在0.58～2.53 mg/kg。說明采樣區(qū)域土壤抗生素殘留較低，存在的風(fēng)險較小，這可能與糞肥施用的時間長短有關(guān)，土壤中的抗生素可能被降解，其中水解是水體中抗生素降解的重要方式，微生物降解在水環(huán)境抗生素的降解中發(fā)揮著極為重要作用，一般降解過程會將抗生素分解為二氧化碳和水[16-17]。同時，也與不同種類抗生素在土壤中的半衰期長短有關(guān)。

3 結(jié)論

在雞飼料和豬飼料中，3種四環(huán)素類抗生素含量均較高，而奶牛飼料中四環(huán)素類抗生素含量相對較低。

糞樣中以雞糞抗生素殘留最高。采樣區(qū)域土壤抗生素殘留較低，抗生素殘留風(fēng)險較小。

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