重組人粒細(xì)胞刺激因子蛋白特性及蛋白重折疊過程雜質(zhì)研究

李潛 李巖異 侯麗媛 張彩喬 張衛(wèi)婷

摘 要：重組人粒細(xì)胞刺激因子（rhG-CSF）是用于治療化療所致的中性粒細(xì)胞減少癥。來源于基因工程的細(xì)胞表達(dá)的包涵體，包涵體經(jīng)過變性、復(fù)性和分離純化等步驟處理后得到藥用級(jí)別的rhG-CSF。本文根據(jù)重組人粒細(xì)胞刺激因子蛋白結(jié)構(gòu)特性，對(duì)包涵體裂解復(fù)性過程中蛋白質(zhì)重折疊過程進(jìn)行總結(jié)，通過對(duì)其重折疊過程的研究，以便于找尋到更優(yōu)化裂解復(fù)性條件，提高下游生產(chǎn)回收率，提高工業(yè)生產(chǎn)效益。

關(guān)鍵詞：重組人粒細(xì)胞刺激因子（rhG-CSF）；包涵體；裂解復(fù)性；蛋白質(zhì)重折疊

重組人粒細(xì)胞刺激因子（rhG-CSF）是近20年來發(fā)展起來的最令人激動(dòng)的新藥物，也是世界上最暢銷的五種重組類生物藥物之一。

粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factors，G-CSF）是能夠在體內(nèi)外特異地作用于中性粒細(xì)胞系，促進(jìn)其增殖、分化，并能維持功能和存活的一種糖蛋白類生長因子[ 1 ]。其在刺激造血細(xì)胞的增殖、分化和血細(xì)胞的功能活性中發(fā)揮著重要作用。例如，它可以刺激相應(yīng)的定向造血祖細(xì)胞分裂，預(yù)防細(xì)胞凋亡，并啟動(dòng)造血亞群發(fā)育并成熟。

1 重組人粒細(xì)胞刺激因子蛋白特性及在大腸桿菌中的表達(dá)特性

成熟的人類G-CSF是一個(gè)由帶有O 聯(lián)糖鏈的174個(gè)氨基酸組成分子質(zhì)量為19.0kd的糖蛋白，在Cys36-Cys42和Cys64-Cys74之間有一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，有一個(gè)游離的半胱氨酸殘基17。

天然的人粒細(xì)胞刺激因子在蘇氨酸（Thr133）有一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)可以保護(hù)蛋白免受聚集，但該位點(diǎn)并不影響蛋白活性。

人G-CSF cDN A有兩種不同的形式，分別編碼174和177個(gè)氨基酸的成熟蛋白。兩種mRNA來源于同一前體分子，其形成機(jī)理是選擇性剪接，兩種不同的G-CSF cDNA分子生物學(xué)活性差別較大，174個(gè)氨基酸形式的G-CSF比177個(gè)氨基酸形式的G-CSF生物學(xué)活性高出50倍以上。G-CSF的編碼基因位于17q21-22，長約23 kb，含有5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子[ 2 ]。

大腸桿菌表達(dá)重組蛋白已經(jīng)成為生產(chǎn)藥用蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)。rhG-CSF是通過重組DNA技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)蛋白藥物，以滿足醫(yī)療上的需求。大腸桿菌表達(dá)的重組人粒細(xì)胞刺激因子rhG-CSF，和相同的內(nèi)源性蛋白質(zhì)有相同的生物活性，但不同的是它氨基端有一個(gè)未糖基化的蛋氨酸殘基。大腸桿菌表達(dá)的非糖基化重組人粒細(xì)胞刺激因子同樣具備生物學(xué)活性。rhG-CSF分子量約18.8kDa、非糖基化、具有175個(gè)氨基酸殘基、多出來的氨基酸為N端的甲硫氨酸、攜帶兩條二硫鍵是生物學(xué)活性所必需。

圖1為重組G-CSF蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)[ 3 ]。大腸桿菌中表達(dá)的重組人粒細(xì)胞刺激因子的Cys37-Cys43和Cys65-Cys75之間有一個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，有一個(gè)游離的半胱氨酸殘基18。

重組蛋白在大腸桿菌中的高水平表達(dá)在體內(nèi)通常積累為不溶性蛋白、無活性聚合物包涵體。它們通過沉積而發(fā)生錯(cuò)折疊或通過疏水性基團(tuán)的暴露和隨之發(fā)生的分子間相互作用部分折疊為多肽。蛋白質(zhì)含有二硫鍵，由于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境抑制二硫鍵的形成，因此蛋白質(zhì)聚集體包涵體的形成是預(yù)料之中的。因此我們需要對(duì)包涵體進(jìn)行體外重折疊，以形成有活性的蛋白天然構(gòu)象。

前期研究表明，rhG-CSF在大腸桿菌中表達(dá)水平為10%。最初，通過改變?cè)诨?端GC含量表達(dá)水平可以提高到17%；通過引入沉默突變表達(dá)水平提高到35%；利用合成基因表達(dá)活性可以到達(dá)30%[ 4 ]。

雖然蛋白質(zhì)的表達(dá)是在中度到高度的水平，終產(chǎn)物的產(chǎn)量很少，遠(yuǎn)不能令人滿意。這很可能是由于下游工藝的效率低下，例如蛋白質(zhì)包涵體分離后的純度和回收率較低，錯(cuò)誤折疊，聚體的形成和蛋白質(zhì)的復(fù)性條件未經(jīng)優(yōu)化以及層析過程。如此多的步驟很麻煩，并且總產(chǎn)率較低，因此高度控制的復(fù)性及純化工藝參數(shù)是必不可少的。

2 蛋白質(zhì)重折疊

蛋白質(zhì)重折疊是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸側(cè)鏈的非共價(jià)結(jié)合形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，和進(jìn)一步側(cè)鏈的排序和組裝以達(dá)到一種相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，最終形成功能齊全的天然結(jié)構(gòu)。任何蛋白質(zhì)的特定構(gòu)象在很大程度上是由多肽鏈的序列以及側(cè)鏈的特定的分子間的相互作用決定的。各種作用力在蛋白質(zhì)的重折疊過程中扮演著積極的角色，包括氫鍵形成，疏水作用（疏水性氨基酸殘基在內(nèi)部核心），共價(jià)相互作用（蛋氨酸和/或半胱氨酸），范德華力，靜電相互作用（帶電表面極性側(cè)鏈）。除了這些，主鏈和側(cè)鏈由于限制運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的構(gòu)象熵也在蛋白質(zhì)重折疊形成一個(gè)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)中扮演著重要角色。人們一直認(rèn)為，蛋白質(zhì)折疊和由此產(chǎn)生的天然構(gòu)象是獨(dú)立自主支配的，并且由一個(gè)特定蛋白的氨基酸的序列及其天然溶劑環(huán)境決定的。

3 裂解復(fù)性過程不同形式雜質(zhì)特性及形成過程

重組人粒細(xì)胞刺激因子蛋白包涵體主要的雜質(zhì)包括脂多糖、宿主細(xì)胞蛋白、質(zhì)粒DNA、RNA聚合酶等各種酶。在重組人粒細(xì)胞刺激因子包涵體裂解復(fù)性過程中，蛋白重折疊時(shí)氧化型及還原型、f-met型和聚體等是rhG-CSF的主要雜質(zhì)。在所有類型的雜質(zhì)中f-met型，是在蛋白表達(dá)過程中產(chǎn)生。氧化型及還原型異構(gòu)體和聚體是最重要的兩類雜質(zhì)，是在包涵體復(fù)性過程產(chǎn)生的，這兩類雜質(zhì)會(huì)影響產(chǎn)品的安全性及有效性。因此針對(duì)這三類雜質(zhì)有必要進(jìn)行重點(diǎn)研究。G-CSF含有5個(gè)半胱氨酸殘基，可形成兩對(duì)二硫鍵（位于36-42，和64-74），二硫鍵的特性及數(shù)量影響蛋白表明的疏水性，通過高效液相我們可以分析出各種組分的疏水性差異。

我們已經(jīng)很清楚，除f-met型及聚體雜質(zhì)外，其余類型G-CSF的疏水性為：還原型>天然型>氧化型。還原型組分為蛋白鏈完全未折疊，而氧化型為蛋白鏈均形成了二硫鍵但并不是天然結(jié)構(gòu)的結(jié)合順序。

根據(jù)高效液相的出峰時(shí)間判斷二硫鍵的配對(duì)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稀釋復(fù)性過程中，在剛稀釋完成時(shí)有38%的正確構(gòu)象的蛋白，說明了自發(fā)形成二硫鍵的情況。復(fù)性30分鐘后，超過90%的蛋白已經(jīng)折疊，其中80%的蛋白已經(jīng)形成了正確的二硫鍵并折疊。在30分鐘至16小時(shí)的時(shí)間里，正確折疊的蛋白比例達(dá)到83%，蛋白濃度為0.25mg/ml。這在A.C Herman和H.J.Dyson的研究中均有提及，二硫鍵Cys37-Cys43比 Cys65-Cys75形成速度快。這就是為什么在復(fù)性的前30分鐘內(nèi)，氧化型組分和天然組分的百分比增長顯著。兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，Cys37-Cys43 Cys65-Cys75，形成的兩個(gè)小環(huán)是已知的生物活性的關(guān)鍵，并且研究表明，二硫鍵的形成在其自身重折疊的最初30min內(nèi)完成。

二級(jí)結(jié)構(gòu)中的螺旋結(jié)構(gòu)在復(fù)性2小時(shí)后趨于平穩(wěn)并形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在0-2小時(shí)的過程中會(huì)形成幾種中間體，影響螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。可以通過核磁共振檢測(cè)不同復(fù)性時(shí)間的蛋白的變化程度，在0-2.5小時(shí)的蛋白溶液顯示峰為1.9ppm，三小時(shí)后峰變?yōu)?.6ppm并直到16小時(shí)一直未發(fā)生明顯變化，中說明需要至少3小時(shí)。盡管在重折疊30min后蛋白質(zhì)功能完善（二硫鍵形成完成），在30min后的不當(dāng)處理可能會(huì)導(dǎo)致蛋白的聚合并且導(dǎo)致產(chǎn)品收率受損?；谌缟蠑?shù)據(jù)，在這些操作條件下推薦重折疊至少2h。同時(shí)聚體也在復(fù)性的4小時(shí)后明顯增多。

4 應(yīng)用

根據(jù)上述重人粒細(xì)胞刺激因子蛋白特性及復(fù)性過程的變化特性，可以設(shè)計(jì)并優(yōu)化工業(yè)化生產(chǎn)工藝，復(fù)性過程中前30分鐘是氧化型異構(gòu)體快速形成過程，因此在此過程中盡量減少促進(jìn)蛋白氧化的因素，如過度攪拌，氧化劑濃度等。

通過深入了解重人粒細(xì)胞刺激因子蛋白特性及復(fù)性動(dòng)力學(xué)過程，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持，為復(fù)性工藝的摸索和優(yōu)化提供更多的思路和方法。

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