利用多功能裂合酶CpcE/F合成非天然重組藻膽蛋白

吝曉君, 王祥法, 葛保勝, 秦 松

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利用多功能裂合酶CpcE/F合成非天然重組藻膽蛋白

吝曉君1, 王祥法1, 葛保勝1, 秦 松2

(1. 中國石油大學(xué)(華東) 生物工程中心, 山東青島266580; 2. 中國科學(xué)院煙臺海岸帶可持續(xù)發(fā)展研究所, 山東煙臺 264003)

藻膽蛋白裂合酶是催化藻膽色素與脫輔基藻膽蛋白亞基共價連接的裂合酶, 在藻膽蛋白的生物合成途徑中發(fā)揮著重要作用。本實驗以藻藍蛋白裂合酶CpcE/F為研究對象, 采用基因工程組合表達技術(shù), 構(gòu)建了pCDFDuet-、pCDFDuet-等重組質(zhì)粒, 并導(dǎo)入大腸桿菌中, 在IPTG的誘導(dǎo)下, 成功表達得到兩種非天然藻膽蛋白ApcA-PEB和PecA-PEB, 這表明CpcE/F不僅可以催化藻藍膽素和脫輔基藻藍蛋白的結(jié)合, 還可以催化藻紅膽素(PEB)與別藻藍蛋白α-亞基(ApcA)和藻紅藍蛋白α-亞基(PecA)的結(jié)合, 因此是一種多功能的裂合酶。根據(jù)重組產(chǎn)物的光譜特征峰分析發(fā)現(xiàn), ApcA-PEB和PecA-PEB作為兩種非天然存在的重組藻膽蛋白, 具有與對應(yīng)天然藻膽蛋白有著相近的特征吸收光譜和熒光發(fā)射峰, 但同時具有明顯的波長偏移并伴有色素異化現(xiàn)象, 其光譜學(xué)性質(zhì)主要由其所攜帶的色素基團決定。另外, 熒光壽命衰減分析發(fā)現(xiàn), 不同脫輔基蛋白對于重組藻膽蛋白的光譜穩(wěn)定性具有重要的影響。

藻膽蛋白; 生物合成; 非天然; CpcE/F裂合酶

藻膽蛋白是存在于藍藻和紅藻中一類重要的捕光色素蛋白。根據(jù)色基的種類及其與蛋白質(zhì)的相互作用, 藻膽蛋白可分為: 藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白和藻紅藍蛋白[1]。近年的研究表明, 藻膽蛋白除了參與光合作用外, 還具有抗氧化、抗腫瘤、消炎等生物功效[2-5], 并且作為優(yōu)良的熒光探針已被廣泛應(yīng)用于免疫熒光檢測等領(lǐng)域[6-7]。

藻膽蛋白裂合酶是催化藻膽色素與脫輔基藻膽蛋白亞基共價連接的裂合酶, 在藻膽蛋白的生物合成途徑中發(fā)揮著重要作用[8-10]。其中CpcE/F是催化藻藍膽素和脫輔基藻藍蛋白亞基連接的裂合酶[11-14]。研究發(fā)現(xiàn)CpcE/F可以催化不同色素基團連接到脫輔基藻藍蛋白亞基上[15-16], 但目前對于CpcE/F是否為一種真正的多功能裂合酶, 可以催化不同色素和不同脫輔基蛋白的連接, 尚不太清楚。該問題的解析將為進一步闡明藻膽蛋白的生物合成機理, 人工合成并改造藻膽蛋白熒光分子奠定重要的理論基礎(chǔ)。

本文以藻藍蛋白裂合酶CpcE/F為研究對象, 構(gòu)建了pCDFDuet-、pCDFDuet-等重組質(zhì)粒, 并導(dǎo)入大腸桿菌中, 采用基因工程組合表達技術(shù), 重組表達得到兩種非天然的藻膽蛋白ApcA-PEB和PecA-PEB, 根據(jù)重組產(chǎn)物的光譜特征峰分析發(fā)現(xiàn), ApcA-PEB和PecA-PEB均具有與天然藻膽蛋白相近的特征吸收光譜和熒光發(fā)射峰, 同時伴有一些色素異化現(xiàn)象和波長偏移。色素蛋白的SDS-PAGE電泳經(jīng)醋酸鋅染色后, 在紫外光照射下發(fā)出熒光, 證明色素與蛋白的連接方式為共價偶聯(lián), 從而證明CpcE/F確實是一種多功能裂合酶, 具有催化合成多種非天然藻膽蛋白的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BL21(DE3)、DH5α感受態(tài)細胞購自天根生物工程公司。DNA回收試劑盒為天根生物工程公司產(chǎn)品, DNA限制性內(nèi)切酶和Taq酶、T4 DNA連接酶等均為TaKaRa產(chǎn)品。

1.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒

根據(jù)NCBI中集胞藻sp. PCC 6803中別藻藍蛋白α-亞基基因(Genebank: CP012832.1)和亞鐵血紅素氧合酶基因(GenBank: CP012832.1),念珠藻sp. PCC 7120中藻紅藍蛋白α-亞基基因(GenebankBA000019.2)和藻紅素鐵氧還蛋白還原酶基因(GenBank: BA000019.2), 以及頓頂螺旋藻中藻藍蛋白裂合酶基因(GenBank: DQ453478.1)序列, 設(shè)計適當(dāng)引物(表1), 經(jīng)PCR擴增后, 克隆到質(zhì)粒pCDFDuet-的適當(dāng)位點(圖1), 得到重組質(zhì)粒pCDFDuet-和pCDFDuet-, 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 挑取單克隆, 經(jīng)測序驗證正確后備用。

表1 重組載體構(gòu)建過程中所使用的引物序列

*注: 表中下劃線部分為限制性內(nèi)切酶酶切位點

1.3 重組色素蛋白的表達與純化

重組色素蛋白以大腸桿菌BL21為宿主細胞進行表達。在含有50 μg/mL壯觀霉素的TB培養(yǎng)基中, 首先37℃培養(yǎng)至600=0.8~1.0, 降溫至18℃, 然后加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達18~20 h后, 離心收集細胞, –20 ℃保存。純化時, 將凍存的細胞重新懸于PBS緩沖液中, 并加入終濃度為0.5 mmol/L的蛋白酶抑制劑PMSF及溶菌酶(0.05 g/100 mL懸浮液)使用高壓細胞破碎儀在1 000~1 500 bar壓力下進行破碎, 破碎液經(jīng)12 000 g離心30 min, 取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。因表達載體pCDFDuet-1中第一個T7啟動子下游有6個組氨酸密碼子, 故所表達重組蛋白也帶有6×His標簽, 可以采用鎳離子螯合層析柱進行純化。

1.4 重組色素蛋白的光譜測定

天然的藻膽蛋白是捕光色素蛋白, 能夠吸收特定波長的光。通過檢測重組后的色素蛋白的光譜, 可以確定其色素的類型以及相關(guān)的物理特征。吸收光譜采用島津UV-2450紫外可見光譜儀測定(掃描范圍400~700 nm, 狹縫寬1 nm); 熒光光譜采用HORIBA JY公司的FluoMax-4熒光光譜儀測定(ex=510 nm,em=520~750 nm, 掃描速度1 nm/s), 狹縫寬度(x: 2 nm,m: 2 nm)。測定均在室溫下進行。

1.5 SDS-PAGE檢測與鋅離子染色

取提純得到的色素蛋白溶液18 μL, 加入7 μL上樣緩沖液(5 μL溴酚藍, 2 μL巰基乙醇), 混勻, 95 ℃熱變性10 min, 進行SDS-PAGE電泳分析(膠濃度為10%)。電泳結(jié)束后, 電泳膠經(jīng)醋酸鋅溶液浸泡5 min, 在紫外燈下成像檢測, 然后再用考馬斯亮藍染色, 脫色并用Alpha凝膠成像儀成像。

1.6 重組色素蛋白的熒光衰減動力學(xué)測定

重組色素蛋白的熒光穩(wěn)定性在FluoMax-4熒光光譜儀(HORIBA JY)上進行。熒光衰減動力學(xué)檢測條件為: 激發(fā)波長ex=510 nm, 檢測波長em=575 nm, 狹縫寬度x為2 nm,m為2 nm, 采樣間隔為120 s/次。檢測在室溫條件下進行。

2 結(jié)果

2.1 重組色素蛋白的純化

將含有pCDFDuet-和pCDFDuet-兩種重組質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達以后, 菌體呈現(xiàn)橙紅色, 表明PEB色素被成功表達。菌體收集后, 4oC經(jīng)高壓細胞破碎儀破碎并離心, 細胞上清液經(jīng)過鎳離子親和層析柱純化, 得到的重組蛋白樣品, 蛋白樣品呈現(xiàn)亮紅色, 可以判定藻紅膽素(PEB)與脫輔基蛋白ApcA和PecA成功連接。

由于文獻報道ApcA具有自催化作用[17], 可以靠自身催化作用偶聯(lián)PCB, 從而形成ApcA-PCB。為了驗證上述連接是自催化作用的結(jié)果, 還是源于裂合酶CpcE/F的催化作用, 我們重新構(gòu)建了不含CpcE/F的對照質(zhì)粒pCDFDuet-和pCDFDuet-并轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)進行表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 盡管菌體呈現(xiàn)為橙紅色, 但是經(jīng)菌體破碎提取重組蛋白, 重組蛋白并沒有顯示紅色, 紅色組分主要集中于流穿液, 另有少部分非特異性吸附于色譜柱中。這表明, 菌體所顯示的紅色為藻紅膽素表達的結(jié)果, 但是由于缺少CpcE/F的催化, 藻紅膽素并沒有與脫輔基蛋白ApcA和PecA相偶聯(lián)。這也進一步說明了, ApcA和PecA與PEB的連接是在CpcE/F的催化作用下形成的。

2.2 重組色素蛋白的SDS-PAGE蛋白電泳及鋅染鑒定

將純化后的重組色素蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測, 由圖3B可以看出, 經(jīng)過考馬斯亮藍染色, 兩種重組蛋白在19 kDa有明顯的條帶, 這與帶有His tag標簽的ApcA和PecA的理論分子質(zhì)量大小基本一致。經(jīng)過一步鎳親和色譜純化后, ApcA的純度可以達到90%以上, PecA的純度略差, 在75%~80%之間。根據(jù)藻膽色素可與Zn2+形成螯合物, 在一定波長光激發(fā)下可以發(fā)射熒光的特性, 從而可以通過鋅離子電泳鑒定藻膽色素與蛋白亞基的連接情況。由圖2A可以看出, 在紫外光照射下, 鋅電泳中重組蛋白條帶發(fā)出橙紅色熒光, 這證明在裂合酶CpcE/F體內(nèi)催化下脫輔基蛋白ApcA與PecA均與色素成功地共價偶聯(lián), 生成了ApcA-PEB和PecA-PEB重組色素蛋白分子。

A . 鋅染的SDS-PAGE譜圖; B. 考染的SDS-PAGE譜圖

A. Zn2+-induced fluorescence of recombinant proteins; B. Coomassie- stained

2.3 重組蛋白的光譜測定與分析

將純化后的PecA-PEB和ApcA-PEB兩種色素蛋白交換到PBS溶液中, 利用吸收光譜和熒光光譜進行對比分析(圖3和圖4)可以看出, 重組蛋白PecA- PEB在497 nm和589 nm處有兩個典型的特征吸收峰, 在564 nm和613 nm處具有對應(yīng)的特征熒光發(fā)射峰。這與天然藻紅藍蛋白在500 nm和570 nm處具有特征吸收類似, 但是本研究并未發(fā)現(xiàn)明顯的可逆光致變換現(xiàn)象, 說明重組PecA-PEB雖然具有兩個特征吸收波長, 但是不具有可逆光致變換活性。對比光譜分析可知, 497 nm處的吸收峰和564 nm的熒光發(fā)射峰, 應(yīng)該是由于PEB異構(gòu)化生成的藻尿膽素PUB造成的, 而589 nm的吸收峰和613 nm的熒光發(fā)射峰應(yīng)該歸因于PtvB[17]。與天然PecA(特征吸收峰在500 nm和570 nm, 特征熒光發(fā)射峰在520 nm和590 nm)和天然藻紅蛋白(最大吸收峰在565 nm, 熒光發(fā)射峰在578 nm)相比, 重組PecA-PEB更接近于天然藻紅藍蛋白的光譜學(xué)性質(zhì), 但由于色素及其脫輔基蛋白微環(huán)境的變化, 本文中重組PecA的吸收和熒光發(fā)射均發(fā)生了顯著的紅移。

天然的ApcA亞基蛋白應(yīng)該結(jié)合PCB色素, 最大吸收在645 nm, 最大熒光發(fā)射在656 nm。本文中重組ApcA-PEB也是一種非天然的藻膽蛋白分子, 其在552 nm有最大吸收峰, 且在496 nm和608 nm處分別具有兩個肩峰, 在564 nm和615 nm處有兩個熒光發(fā)射峰。經(jīng)分析可知, 496 nm的吸收峰可能是由于PEB異構(gòu)化所生成PUB的吸收, 608 nm處的吸收可能是ApcA-PEB所形成六聚體的吸收峰[16]。552 nm處的吸收峰為ApcA結(jié)合PEB的吸收峰?？梢钥闯? 脫輔基蛋白ApcA在結(jié)合PEB后, 其吸收和熒光光譜也會發(fā)生很大的變化, 本文中構(gòu)建的ApcA-PEB更接近于R-PeA的吸收和熒光等光譜學(xué)特征, 但是由于脫輔基蛋白微環(huán)境的變化以及重組色素的異構(gòu)化, 使該色素蛋白的光譜也發(fā)生了一定的藍移或紅移現(xiàn)象。

由以上結(jié)果可以看出, CpcE/F是一種多功能的裂合酶, 不僅可以催化PCB連接到藻藍蛋白和別藻藍蛋白亞基上, 還可以催化PEB連接到別藻藍蛋白和藻紅藍蛋白亞基上, 從而生產(chǎn)一些非天然的藻膽蛋白分子, 該非天然藻膽蛋白分子可以具有與天然藻膽蛋白相近或截然不同的光譜學(xué)性質(zhì)。但是需要指出的是, CpcE/F作為一種多功能裂合酶, 對于催化PEB連接反應(yīng)的時候, 特異性略差, 容易產(chǎn)生色素的異構(gòu)化, 衍生出PUB或者PtVB (phytoviolobilin)[9]等色素, 從而導(dǎo)致了重組色素蛋白熒光峰和吸收峰的偏移。

2.4 重組蛋白的熒光穩(wěn)定性分析

根據(jù)以上的實驗結(jié)果表明, APC和PEC均可共價結(jié)合PEB, 形成熒光蛋白。但是它們在穩(wěn)定性方面存在顯著的差異。重組蛋白的穩(wěn)定性是與其熒光強度相關(guān)的, 即穩(wěn)定性越好, 那么其熒光強度越穩(wěn)定。熒光壽命衰減動力學(xué)試驗表明, 重組蛋白ApcA-PEB的光譜學(xué)穩(wěn)定性明顯優(yōu)于PecA-PEB(圖5)。在所測量的時間范圍內(nèi), 色素蛋白ApcA-PEB的熒光強度幾乎不變, 而PecA-PEB的熒光強度, 在前2 500s內(nèi), 迅速衰減, 隨后衰減速率慢慢減小。從重組蛋白的表象來看, 隨著時間的推移重組蛋白ApcA-PEB其顏色隨著時間延長未發(fā)生明顯變化, 在4℃條件下可以存放數(shù)周, 顏色未見明顯褪色。但是重組蛋白PecA-PEB的顏色隨著時間的延長逐漸變淺, 即使在4℃條件下, 3d后即褪至無色或微紅色。

3 討論

藻膽蛋白是一種重要的熒光探針分子, 已在熒光免疫檢測中廣泛應(yīng)用。但天然藻膽蛋白主要有藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白和藻紅藍蛋白等幾種, 種類及光譜學(xué)性質(zhì)較為單一, 如果能通過基因工程或蛋白質(zhì)工程手段生產(chǎn)一些具有優(yōu)良光譜學(xué)性質(zhì)的非天然藻膽蛋白, 那么就能大大拓寬這一重要熒光分子的應(yīng)用范圍。

隨著藻類基因組學(xué)的發(fā)展, 對藻膽蛋白的生物合成途徑的理解已經(jīng)取得了重要進展。這使得利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組藻膽蛋白成為可能, 并被迅速廣泛應(yīng)用。藻膽蛋白色素裂合酶主要催化脫輔基藻膽蛋白和藻膽色素的連接, 在藻膽蛋白的生物合成過程中發(fā)揮著重要的作用。CpcE/F裂合酶最早被發(fā)現(xiàn)是應(yīng)用于藻藍膽素和藻藍蛋白α亞基脫輔基蛋白的結(jié)合。前期, Alvey等證明, CpcE/F可以催化CpcA共價偶聯(lián)不同的藻膽色素, 如PEB, PCB, PUB, PVB等[18]。本實驗結(jié)果表明CpcE/F裂合酶還可以催化脫輔基蛋白ApcA和PecA 共價偶聯(lián)藻紅膽素PEB, 形成具有特定光學(xué)性質(zhì)的色素蛋白。由此可見, CpcE/F是一種多功能裂合酶, 可以催化不同脫輔基蛋白和不同藻膽色素之間的共價偶聯(lián)反應(yīng), 因此在利用藻膽蛋白基因工程獲得新型藻膽蛋白分子方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

本文中所制備的ApcA-PEB和PecA-PEB均為非天然藻膽蛋白, 其吸收光譜和熒光光譜與天然ApcA和PecA有顯著的差異, 這為進一步構(gòu)建新型非天然藻膽蛋白分子奠定了重要的基礎(chǔ)。由于兩種非天然藻膽蛋白分子脫輔基蛋白相差較大, 但是都帶有PEB色素或異化色素, 從吸收光譜和熒光光譜來看, 它們所攜帶色素的光譜學(xué)性質(zhì)更為接近, 這說明藻膽蛋白的光譜學(xué)性質(zhì)主要取決于所偶聯(lián)的色素基團, 但是脫輔基蛋白通過提供不同的色素微環(huán)境, 也會為該藻膽蛋白分子的光譜學(xué)性質(zhì)造成顯著的影響。通過對該兩種色素蛋白的熒光衰減動力學(xué)分析, 發(fā)現(xiàn)兩種色素蛋白的光譜學(xué)穩(wěn)定性有很大差別。這表明不同脫輔基蛋白盡管對色素蛋白的光譜學(xué)性質(zhì)沒有決定性的作用, 但是它們通過提供不同的色素微環(huán)境, 可以對色素蛋白的光譜學(xué)穩(wěn)定性產(chǎn)生重要影響。因此, 在將來藻膽蛋白基因工程改造新型藻膽蛋白分子過程需要綜合考慮脫輔基蛋白和色素兩方面的因素, 以期獲得光譜學(xué)性質(zhì)優(yōu)良且光穩(wěn)定性較好的熒光分子。

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(本文編輯: 康亦兼)

Biosynthesis of unnatural phycobiliproteins using universal bilin lyase CpcE/F

LIN Xiao-jun1, WANG Xiang-fa1, GE Bao-sheng1, QIN Song2

(Center for Bioengineering and Biotechnology, China University of Petroleum (east China), Qingdao 266580, China; Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China)

Phycobilin lyase enzymes can attach phcobilins to their cognate apoproteins, which play an important role in the biosynthesis of phycobiliproteins. To verify the universal function of lyase cpcE/F, two recombinant plasmids: pCDFDuet--and pCDFDuet-were constructed using genetic engineering methods, and then two unnatural phycobiliproteins, ApcA-PEB and PecA-PEB, were successfully expressed in, which indicated that cpcE/F could catalyze not only the ligation of PCB with different apoproteins, but also that of PEB and different apoproteins, and thus are universal bilin lyases. The absorption and fluorescence spectrum analysis showed that both unnatural proteins exhibit similar characteristic peaks to those of natural phycobiliproteins with some peaks of isomers and wavelength shifts, and their spectroscopic characteristics were mainly determined by the bilin type carried on them. Furthermore, different apoproteins could also regulate the absorption spectrum and show important influences on the photostability of phycobilins. Our work will provide important information to better understand the biosynthetic mechanism of the phycocybiliproteins and production of unnatural phycobiliproteins with a better fluorescence quality.

phycocybiliproteins; biosynthesis; unnatural; CpcE/F lyase

May 12, 2016

[National High Technology Research and Development Program of China (863 project) (No. 2014AA093505); national natural science fund project (No. 41176144)]

Q784

A

1000-3096(2017)03-0068-07

10.11759/hykx20160512001

2016-05-12;

2016-11-24

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(No. 2014AA093505); 國家自然科學(xué)基金項目(No. 41176144)

吝曉君(1992-), 女, 山東聊城人, 碩士, 主要從事藻膽蛋白的生物合成及人工進化, 電話: 0532-86981132, E-mail: xiaojunlin81@126.com; 葛保勝, 通信作者, 電話: 0532-86981132, E-mail: ggester@126.com