多氯聯(lián)苯在兩種海洋微藻中毒性效應(yīng)及富集效應(yīng)的研究

吳 越, 陳星星, 潘齊存, 鄭伊諾, 胡 園, 王瑤華, 陸榮茂, 黃振華

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多氯聯(lián)苯在兩種海洋微藻中毒性效應(yīng)及富集效應(yīng)的研究

吳 越, 陳星星, 潘齊存, 鄭伊諾, 胡 園, 王瑤華, 陸榮茂, 黃振華

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所浙江省近岸水域開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江溫州 325005)

通過分析2, 2', 3, 4, 4', 5'-六氯聯(lián)苯(PCB138)對牟氏角毛藻()和亞心形扁藻()生長的影響, 以及PCB138對兩種微藻超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性的影響, 研究多氯聯(lián)苯對海洋微藻的毒性效應(yīng), 并采用氣相色譜法研究了兩種微藻對PCB138的生物富集效應(yīng)。結(jié)果表明, PCB138對牟氏角毛藻和亞心形扁藻均有明顯的毒性效應(yīng)作用, 對2種藻類的96 h半抑制質(zhì)量濃度(96hEC50)分別為0.057 mg/和0.354 mg/L, 與亞心形扁藻相比, 牟氏角毛藻對PCB138更敏感, 耐受性更差; 低濃度的PCB138對兩種微藻SOD酶活性有誘導(dǎo)作用, 但當(dāng)PCB138濃度過高時(shí), SOD酶活性下降; 兩種微藻對PCB138均有明顯的富集作用, 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長, 牟氏角毛藻中富集的PCB138含量呈上升趨勢, 而亞心形扁藻中PCB138含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。

多氯聯(lián)苯; 海洋微藻; 毒性效應(yīng); 生物富集

多氯聯(lián)苯是一種典型的持久性有機(jī)污染物, 由聯(lián)苯1-10位的氫原子被一個(gè)或多個(gè)氯原子取代后形成的一大類氯代烴類化合物的總稱, 其同分異構(gòu)體多達(dá)209種, 簡稱為PCBs(polychlorinated biphenyls)。多氯聯(lián)苯具有低水溶性、高脂溶性的特征, 通過食物鏈的傳遞、富集及放大, 環(huán)境中被植物和水生生物吸收的PCBs的富集系數(shù)會達(dá)到數(shù)百萬倍[1]。人類是食物鏈中的最高級消費(fèi)者, PCBs的富集效應(yīng)會導(dǎo)致人體受到最高濃度的毒害。已有研究表明, 多氯聯(lián)苯可干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng), 對神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生生理毒性[2-4]。2001年聯(lián)合國在瑞典召開了環(huán)境大會并通過了《持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》, PCBs被列為首批消除的12種持久性有機(jī)污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)之一[5]。

微藻是一種單細(xì)胞生物, 具有繁殖快、對毒物敏感等特點(diǎn), 被廣泛應(yīng)用于水域環(huán)境污染的毒理研究[6-9]。在水域生態(tài)系統(tǒng)中, 微藻是PCBs進(jìn)入食物鏈的起點(diǎn), PCBs通過食物鏈被生物體吸收并在體內(nèi)富集, 影響生物個(gè)體的健康水平, 進(jìn)而對水域生態(tài)系統(tǒng)的健康構(gòu)成威脅。藻類的種類、生物量及生長速率等因素均能影響PCBs的富集和遷移[10]。通過分析PCBs脅迫下藻類的生長、理化情況以及微藻對PCBs的富集能力, 可了解PCBs對藻類的毒性效應(yīng), 并為水域中多氯聯(lián)苯污染的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測評估與生物防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。已經(jīng)有有關(guān)該方面的報(bào)道, 聶湘平等探討了多氯聯(lián)苯對兩種淡水藻類的生長的研究[11]; 方浩等[12]研究了多氯聯(lián)苯對珠江口兩種赤潮優(yōu)勢種的毒性效應(yīng)。但對海洋微藻對多氯聯(lián)苯的毒性脅迫應(yīng)答和生物富集方面的研究和數(shù)據(jù)積累仍然不是很多。

本試驗(yàn)以兩種常見的海洋餌料微藻牟氏角毛藻()和亞心形扁藻()為材料, 研究多氯聯(lián)苯對其毒性效應(yīng)以及其在藻體中的生物富集作用, 以期為多氯聯(lián)苯對水生生態(tài)系統(tǒng)造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估及其控制治理提供數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

藻種牟氏角毛藻()和亞心形扁藻()均為浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所實(shí)驗(yàn)室保存種; 培養(yǎng)微藻所用的海水采自浙江省溫州市洞頭縣, 經(jīng)醋酸纖維薄膜抽濾, 在 121℃滅菌 20 min待用; 試驗(yàn)所用多氯聯(lián)苯為PCB138, 購買于上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司, 純度為 99.5%; 實(shí)驗(yàn)時(shí)先用丙酮助溶配成母液待用; SOD酶活檢測試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微藻培養(yǎng)方法

微藻用f/2培養(yǎng)基在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 溫度為25℃±0.5℃, 光照強(qiáng)度為2 500 lx, 光暗周期比為12 h︰12 h, 每日定時(shí)搖動3次并隨機(jī)更換錐形瓶位置。

1.2.2 急性毒性試驗(yàn)

兩種微藻培養(yǎng)至指數(shù)生長期, 按表1設(shè)置試驗(yàn), 每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行, 并各設(shè)置對照組。在暴露于PCB138下0、24、48、72、96 h后, 每組取1 mL藻液, 在波長680 nm下測定微藻吸光度, 對照組微藻吸光值為參比0, 計(jì)算微藻生長相對抑制率= (0–)/0。96 h半效應(yīng)濃度96h50計(jì)算參考李卓娜的概率單位-濃度對數(shù)法, 通過直線回歸得到濃度效應(yīng)方程, 當(dāng)概率單位為5時(shí), 計(jì)算96h50[13]。

表1 兩種微藻急性毒性試驗(yàn)

Tab.1 Acute toxicity test of PCB138 in C. muelleri and P. subcordiformi

1.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

PCB138各濃度組和對照組的兩種微藻分別在處理0、24、48、72、96 h 后取樣, 用試劑盒測定SOD酶活性。

1.2.4 兩種微藻對PCB138富集作用

根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置低、中、高三組處理濃度和對照組, 在PCB138處理24、48、72、96、120 h后取藻液用0.45 μm濾膜過濾, 濾膜烘干至恒重, 按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.190-2014[14]用氣相色譜法測定微藻中PCB138的含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS19.0和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCB138對兩種微藻生長的影響

PCB138對牟氏角毛藻和亞心形扁藻的生長均有一定程度的影響。試驗(yàn)開始24 h后, 0.01 mg/L濃度PCB138處理下的牟氏角毛藻已開始出現(xiàn)顯著生長抑制作用(<0.05), 0.1 mg/L濃度PCB138處理下的亞心形扁藻細(xì)胞生長相對于對照組也出現(xiàn)明顯差異(<0.05); 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長和處理濃度的升高, PCB138對兩種微藻的抑制作用顯著加強(qiáng), PCB138與2種藻細(xì)胞增殖呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(圖1)。細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化引起的膜損傷是環(huán)境污染物抑制微藻生長的重要原因[15-16]。在本研究中, 在高濃度PCB138處理下, 觀察發(fā)現(xiàn)兩種藻液在后期沉淀增多, 扁藻藻液顏色發(fā)黃, 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)兩種微藻細(xì)胞碎片增多, 扁藻細(xì)胞聚集成團(tuán)狀, 細(xì)胞活動停滯, 說明隨著PCB138處理濃度的升高和處理時(shí)間的延長, 微藻細(xì)胞的耐受能力達(dá)到極限, 細(xì)胞膜和葉綠體膜結(jié)構(gòu)受損, 細(xì)胞生長增殖受到抑制(圖2)。

由SPSS19.0進(jìn)行分析計(jì)算得到PCB138對牟氏角毛藻的96hEC50為0.057mg/L, 對亞心形扁藻的96hEC50為0.354mg/L。根據(jù)《新化學(xué)物質(zhì)危害評估準(zhǔn)則(HJ /T154-2004)》[17]提出的評判標(biāo)準(zhǔn)(極高毒性物質(zhì): EC50(mg/L)<1; 高毒性物質(zhì): 1

2.2 PCB138對微藻SOD酶活性的影響

PCB138暴露24 h和48 h后, 0.10 mg/L和0.12 mg/L濃度處理組牟氏角毛藻SOD酶活性極顯著上升(<0.01), 而0.01、0.05和0.075 mg/L組未出現(xiàn)誘導(dǎo)升高效應(yīng); PCB138暴露72 h后, 0.01 mg/L組牟氏角毛藻與對照組相比SOD酶活性沒有明顯提高, 而0.05 mg/L組SOD酶活性出現(xiàn)極顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)(<0.01), 且隨著PCB138濃度的繼續(xù)升高SOD酶活性上升, 在0.75 mg/L時(shí)達(dá)到最高, 之后開始下降。PCB138暴露96 h后SOD酶活性隨PCB138濃度變化趨勢與72 h情況相似。在整個(gè)試驗(yàn)過程中, 0.01、0.05和0.075 mg/L組牟氏角毛藻的SOD活性隨著暴露時(shí)間的延長逐漸上升, 而0.10 mg/L和0.12 mg/L組牟氏角毛藻SOD活力隨著時(shí)間的延長先升高, 在處理后期則有所下降(圖3A)。

PCB138暴露24 h后, 各濃度處理組的亞心形扁藻與對照組相比未出現(xiàn)顯著差異(>0.05)。PCB138暴露48 h后, 0.1 mg/L和0.2 mg/L濃度組SOD酶活性有所升高, 但與對照組差異不顯著(>0.05), 而0.3、0.4和0.5 mg/L濃度組SOD酶活性均有極明顯升高(<0.01)。PCB138暴露72 h后, 各處理組亞心形扁藻與對照組相比SOD酶活性均有升高, 整體上隨著PCB138濃度的升高SOD酶活性上升, 在0.3 mg/L時(shí)達(dá)到最高, 之后開始下降。其中0.1mg/L、0.1mg/L和0.3mg/L濃度組呈現(xiàn)極顯著誘導(dǎo)效應(yīng)(<0.01), 0.4 mg/L濃度組酶活力顯著上升(<0.05), 0.5 mg/L濃度組酶活力也有升高但與對照組差異不顯著(>0.05)。PCB138暴露96 h后0.1 mg/L濃度組亞心形扁藻SOD酶活性極顯著上升(<0.01), 但隨著PCB138濃度的繼續(xù)升高, SOD酶活性開始下降, 0.4 mg/L和0.5 mg/L濃度組SOD酶活受到抑制。整個(gè)試驗(yàn)過程中, 0.1、0.2 mg/L組牟氏角毛藻的SOD活性隨著暴露時(shí)間的延長逐漸上升, 而0.3、0.4和0.5 mg/L組牟氏角毛藻SOD活力隨著處理時(shí)間的延長先升高, 在處理后期則受到抑制(圖3B)。

*和**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著

* and ** indicate differences at the 0.05 and 0.01 levels, respectively

在低濃度PCB138作用下, 牟氏角毛藻和亞心形扁藻SOD酶力均呈現(xiàn)一定的應(yīng)激活性, 當(dāng)PCB138濃度過高時(shí), 微藻的SOD酶活性開始下降, 甚至受到抑制作用。這與聶湘平等[11]研究PCB1254對蛋白核小球藻和斜生柵藻SOD活性影響、李娜等[18]研究了PCB169對蛋白核小球藻和斜生柵藻, 孟范平等[20]研究BDE-47對4種海洋微藻抗氧化酶活性的影響得到的結(jié)果相類似, 即低濃度的PCB138可誘導(dǎo)微藻SOD酶活性, 當(dāng)PCB138濃度過高時(shí), 微藻SOD酶活性受到抑制。在低濃度多氯聯(lián)苯的作用下, 微藻細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧自由基增加, 微藻細(xì)胞在這種逆境脅迫下產(chǎn)生更多的SOD酶清除自由基以抵御多氯聯(lián)苯對細(xì)胞的毒性作用。當(dāng)多氯聯(lián)苯濃度超過微藻耐受極限時(shí), 微藻細(xì)胞受到損傷, 其體內(nèi)的活性氧防御系統(tǒng)遭到破損, 則SOD酶活性受抑制。

2.3 兩種微藻對PCB138的富集作用

在0.01 mg/L濃度PCB138處理下, 牟氏角毛藻中PCB138含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長略有上升, 而0.05 mg/L和0.12 mg/L濃度PCB138處理下牟氏角毛藻中PCB138含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長顯著升高。三組濃度的牟氏角毛藻均在120 h時(shí)達(dá)到最大值, 分別為0.026、0.172、0.187 mg/g(圖4A)。在0.1、0.3和0.5 mg/L三組濃度PCB138處理下, 亞心形扁藻中PCB138含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。0.1 mg/L和0.3 mg?L濃度PCB138處理下的亞心形扁藻在72 h藻體中PCB138含量達(dá)到最高值, 分別為0.206 mg/g和0.395 mg/g。0.5 mg/L濃度PCB138處理下的亞心形扁藻在48h藻體中PCB138含量達(dá)到最高值0.354 mg/g(圖4B)。兩種微藻對PCB138都有明顯的生物富集作用。

微藻對有機(jī)物的富集是一個(gè)復(fù)雜的生化過程, 在短期內(nèi)以生物吸附為主[21]。生物吸附可以分為兩個(gè)階段: 第一階段以物理吸附為主, 吸附過程進(jìn)行得較快, 主要發(fā)生在細(xì)胞壁表面; 第二階段以化學(xué)吸附為主, 在這一階段被吸附物質(zhì)可以通過主動運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部, 這個(gè)過程中需要消耗細(xì)胞新陳代謝所產(chǎn)生的能量, 進(jìn)行得較慢[22]。牟氏角毛藻在PCB138處理下, 其富集作用隨著PCB138質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng), 且隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長, 各組牟氏角毛藻中PCB138含量均有所升高, 其升高速率呈現(xiàn)先快后慢的趨勢。這與石瑛等[23]研究角毛藻對有機(jī)污染物1, 4-二氯苯富集作用的結(jié)果類似。而亞心形扁藻在0.1 mg/L濃度和0.3 mg/L濃度的PCB138處理下, 其藻體中 PCB138含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 在0.5 mg/L濃度的PCB138處理下, 其藻體中PCB138含量隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢, 這可能是與其吸附的PCB138量增多有關(guān)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 牟氏角毛藻和亞心形扁藻對PCB138均有明顯的富集作用, 這為兩種微藻用于檢測海水中多氯聯(lián)苯環(huán)境污染提供了依據(jù)。

3 結(jié)論

PCB138對兩種海洋微藻的生長均有明顯的影響。隨著處理濃度的增加和處理時(shí)間的延長, 兩種微藻的生長抑制率升高。PCB138對兩種藻類的生長作用呈現(xiàn)顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。PCB138對兩種微藻均有極高毒性, 亞心形扁藻對PCB138的毒性耐受性比牟氏角毛藻較要高。

在PCB138作用下, 兩種微藻的SOD酶活性有較明顯的變化。低濃度的PCB138對兩種微藻SOD酶活性有誘導(dǎo)作用, 但當(dāng)PCB138濃度過高時(shí), 兩種微藻SOD酶活性均受到抑制。

兩種微藻對PCB138都有明顯的富集作用。隨著PCB138濃度升高, 牟氏角毛藻對PCB138的富集增強(qiáng), 而亞心形扁藻對PCB138的富集作用則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

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(本文編輯: 康亦兼)

A study of toxicity and bioaccumulation of PCBs in two species of marine microalgae

WU Yue, CHEN Xing-xing, PAN Qi-cun, ZHENG Yi-nuo, HU Yuan, WANG Yao-hua, LU Rong-mao, HUANG Zhen-hua

(Zhejiang Mariculture Research Institute, Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bioresource, Wenzhou 325005, China)

In order to investigate the toxicity effects of PCBs on marine microalgae, two algae species,andwere selected to study the effects of PCB138on growth and SOD enzyme activities. Meanwhile, the enrichment effects of PCB138onandwere analyzed by gas chromatography. The results showed that PCB138had obvious toxicity effects on the growth ofand96-h EC50of PCB138onandwere 0.057 mg?L–1and 0.354 mg?L–1, respectively, which indicated thatshowed more sensitivity and poorer tolerance to PCB138than. SOD activities in two microalgae cells were greatly induced by low levels of PCB138, and reduced as the PCB138concentrations increased above threshold values. Both of the algae species had strong capabilities to accumulate PCB138. The adsorption amount of PCB138inincreased with increasing cultivation time, while the amount of PCB138adsorbed infirst increased, then decreased.

polychlorinated biphenyls (PCBs); marine microalgae; toxicity effect; bioaccumulation

Mar. 2, 2016

[Opening fund of Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and Preservation of Coastal Bio-Resource, NO. (J2013010); Public technologyresearch and agricultural project of Zhejiang Province, NO. (2014C32079); Scientific technology project of Zhejiang Province, NO. (2015F30021)]

X171.5

A

1000-3096(2017)03-0061-07

10.11759/hykx20160302004

2016-03-02;

2016-05-12

浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(J2013010); 浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2014C32079); 浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015F30021)

吳越(1984-), 女, 浙江溫州人, 碩士研究生, 助理研究員, 研究方向?yàn)闈O業(yè)生理生化, 電話: 0577-88231983, E-mail: wuy198412@ aliyun.com; 黃振華, 通信作者, E-mail: huangzhenhua0112@163.com