黃瓜側蔓扦插技術及其枯萎病抗性鑒定

劉峻蓉，錢春桃

（1.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，云南 昆明 650031；2.南京農(nóng)業(yè)大學新農(nóng)村發(fā)展研究院有限公司，江蘇 常熟 210095）

黃瓜枯萎病是我國乃至世界黃瓜生產(chǎn)上的主要病害之一，其常年發(fā)病率為10%～30%，病重年份可達80%～90%[1]。而且，由于連年種植，土壤中枯萎病菌大量積累，發(fā)病率逐年增加，發(fā)病期亦有提前趨勢[2]。黃瓜枯萎病病原菌主要為尖孢鐮刀菌黃瓜專化型[Fusarium oxysporum（Sch1.）Emend. Snyd. & Hans.]。在我國流行的菌系為尖孢鐮刀菌4號生理小種（F. oxysporumf.sp.cucumerinum）[3]。

最安全、最有效的防止黃瓜枯萎病的方法是開展抗病育種，對黃瓜材料枯萎病抗性進行鑒定評價則是黃瓜抗病育種的前提。有人研究利用同工酶酶譜的變化[4]和愈傷組織的離體鑒定來評價抗性，但是這些方法對技術和設備的要求很高，在生產(chǎn)上無法推廣；而目前在生產(chǎn)上廣泛應用的苗期胚根和蘸根接種鑒定方法結果最可靠，但是工作量大、周期長，而且，這2種方法都容易導致被接種黃瓜資源的死亡、丟失，這無疑在一定程度上阻礙了黃瓜育種。因此，如何構建一套實用安全、可靠的鑒定方法，仍是黃瓜抗性種質(zhì)資源創(chuàng)制和抗性育種的重要基礎工作。

扦插技術可以增加繁殖系數(shù)，縮短育種進程，降低育苗費用，所以在黃瓜實際生產(chǎn)上具有一定推廣價值。如果能夠利用側枝進行抗性接種鑒定，即使側枝發(fā)生枯萎病而死亡，仍能避免植株接種死亡。目前，對于黃瓜扦插的研究報道還較少。試驗通過不同基質(zhì)及激素對比研究了對黃瓜側蔓基質(zhì)扦插和水扦插的影響，旨在探索適宜黃瓜側蔓扦插成活的條件和方法，并探索利用這些扦插苗進行黃瓜枯萎病的接種鑒定研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

基質(zhì)扦插所用材料：試驗用黃瓜品種為北京截頭。待該品種進入抽蔓期，選取健壯無病的側蔓頂端部位作插穗。

水扦插所用材料：試驗用黃瓜品種分別選用了抗、感黃瓜枯萎病的品種。第1批取樣品種為CC2、5409F、5237F、5238F、5713F、5203F、5707F；第2批取樣品種為5702F、5703F、5704F、5705F、5706F、5338F、5237F、5201F、5202F、5207F、5208F、5218F、5219F，每品種各取10株。2014年5月份待品種進入抽蔓期，選取健壯無病的側蔓頂端部位作插穗。

1.1.2 病原物

病原物為云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院蔬菜課題組實驗室自培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

選取健康植株的側蔓作為材料。將側蔓用經(jīng)75%酒精消毒的刀片在緊靠莖節(jié)處用直角切法切取7～10 cm長的插穗（要求切口平滑）；去掉基部葉片，上部保留2～3片葉片。

1.2.1 基質(zhì)扦插

1.2.1.1 基質(zhì)及容器準備

選取顆粒較大的河沙，清洗后進行高壓滅菌，盛裝于規(guī)格為45 cm×30 cm×20 cm的穴盤中。將花泥進行切割，盛裝于另一相同規(guī)格的穴盤中，然后用無菌水灌透。每小塊花泥均為相同的等腰梯形，在上方預先打孔（約2 cm深），待插入插穗后用河沙填滿孔隙。

1.2.1.2 扦插

將用NAA 1、2 mL/L，ABT 1、2 mL/L及清水浸蘸的插穗各14枝分為2組，一組扦插于花泥中，一組扦插于河沙中。自然環(huán)境下試驗于5月17日開始，培養(yǎng)室環(huán)境下只進行清水處理，試驗于5月27日開始；試驗均于6月5日結束。

1.2.1.3 扦插后管理

自然環(huán)境下，扦插后3 d適當遮陰，4～6 d中午前后遮陰，7 d后不必遮陰。白天氣溫保持在25 ℃左右，夜間氣溫為16～18 ℃，空氣相對濕度為80%～90%，濕度過高可打開穴盤蓋上的天窗通風。培養(yǎng)室環(huán)境下，恒溫26 ℃，日光燈持續(xù)光照，適時噴水，保持相對濕度為80%～90%。

1.2.2 水插

將插穗取下后立即用NAA 1、2 mL/L，ABT 1、2 mL/L及清水（對照）浸蘸基部約3～5 s，待稍干后供扦插用。利用高壓滅菌的三角瓶進行無菌水扦插培養(yǎng)，扦插后將三角瓶置于培養(yǎng)室。每天早晚觀測1次，晚上把扦插苗從26 ℃組織培養(yǎng)室里移至室溫條件下（18～20 ℃），每天換1次水，防止爛根。

1.2.3 利用水插生根側蔓進行接種鑒定

在扦插基礎上，挑取保存的黃瓜枯萎病病原菌，用無菌水稀釋到約1×（105～106）個/L，把已經(jīng)生根的扦插苗在病原菌溶液中浸泡大約30 min，然后再放入原容器中，觀察扦插苗后續(xù)癥狀。

2 結果與分析

2.1 基質(zhì)扦插效果及其影響因素分析

2.1.1 生長調(diào)節(jié)劑對插穗的影響

表1試驗結果表明，河沙組扦插苗的生根和生長情況均優(yōu)于花泥組（表1）。在同一種類同一濃度生長調(diào)節(jié)劑ABT（1 mL/L）處理下，河沙組插穗生根率（57.1%）明顯大于花泥組（28.6%），且最大根長可達花泥組的2.2倍左右。另外，河沙組插穗生長旺盛，其株高明顯大于花泥組。

表1 自然條件下生長調(diào)節(jié)劑對插穗的影響

2.1.2 生長調(diào)節(jié)劑對插穗再生根的影響

試驗結果表明，花泥組插穗易形成愈傷組織，并在愈傷組織基礎上萌生乳白色的根，這種根粗短而光滑，而河沙組插穗未形成愈傷組織，直接形成細長而且表面粗糙的根。另外，除了在莖節(jié)下部周圍發(fā)根，也偶見在節(jié)間長出根的現(xiàn)象，表明黃瓜插穗易生出不定根。

正常情況下，葉和根是同時萌發(fā)的。在試驗中發(fā)現(xiàn)，成活的插穗中仍有部分尚無發(fā)根跡象，但其長勢良好，可能是假活現(xiàn)象，即插穗在一定溫度和濕度條件下即便不生根也可萌發(fā)葉和芽，這時葉和芽生長所需養(yǎng)分來源于插穗中原有的養(yǎng)分。

2.1.3 影響因素分析

2.1.3.1 生長調(diào)節(jié)劑的影響

從表1可以看出，清水對照處理的插穗有一定的成活率，但其生根率及最大根長明顯小于經(jīng)生長調(diào)節(jié)劑處理的插穗，說明使用生長調(diào)節(jié)劑處理是必要的，而且不同濃度的NAA和ABT溶液對用河沙和花泥2種基質(zhì)扦插的插穗均具有一定的生根促進作用。河沙組表現(xiàn)尤為明顯，各生長調(diào)節(jié)劑處理下的生根率可達對照的2～4倍。生長調(diào)節(jié)劑處理的效果以ABT更優(yōu)。另外，從2種濃度看，低濃度生長調(diào)節(jié)劑處理效果反而優(yōu)于高濃度，其中ABT 1 mL/L對刺激生根效果最好，其次為NAA 1 mL/L。經(jīng)ABT 1 mL/L處理后的插穗最大根長可達對照的2倍左右。

2.1.3.2 環(huán)境的影響

培養(yǎng)室條件下（26 ℃，光周期16 h/8 h），扦插后3 d可見根，且根系生長迅速，在試驗期的20 d內(nèi)生根率高達68.3%（表2），最大根長為13.6 cm；而自然環(huán)境下溫度不易控制，夜間溫度較低，根系發(fā)育緩慢，扦插后10 d才見根，在試驗期的20 d內(nèi)生根率僅為25.7%，其成活率也明顯低于培養(yǎng)室組。另外，在不同環(huán)境下，仍表現(xiàn)為河沙組扦插效果優(yōu)于花泥組。當長至1片真葉展開、根系發(fā)育良好時，便可以育苗移栽。

表2 不同環(huán)境對扦插的影響

2.1.3.3 基質(zhì)性質(zhì)的影響

花泥雖然持水力強，保濕性好，但因其質(zhì)地細密，不利于根系生長；而河沙疏松、通透性較好，能滿足黃瓜生育環(huán)境要求，有利于根的萌發(fā)和伸展。

2.1.3.4 側枝狀況及操作要點

從健壯無病的植株上取長l0 cm、有2～3個節(jié)的側枝。側枝要用鋒利的刀片斜切取，而不要用鈍剪或手折，保持切口整齊，防止側枝表皮造成較大傷口，不易愈合。把切取的側枝上展開的葉片全部去掉，只剩下生長點處的小葉片，在陰涼背風處放30 min，以利傷口自然愈合。

扦插苗由于沒有主根，只有側根，根層較淺，所以栽培管理上要比種子苗更要注意勤追肥嚴澆水，少量多次進行。而且扦插苗在生長前期的5節(jié)以下的幼瓜要及早摘除，以促進植株健壯生長。

2.2 水插效果及其影響因素分析

與基質(zhì)扦插一樣，水插也可以獲得扦插苗，但是扦插苗比較細長，莖端發(fā)出的根細而長（圖1），而基質(zhì)扦插所獲得的苗多、短且較密，莖端發(fā)根多，也較粗。水插生根所需要的時間大致為3～7 d內(nèi)可以從切取的部位看見白色氣生根。

圖1 側蔓扦插效果

扦插母本植株的帶菌情況對插條的成活率影響非常大。如果插條已經(jīng)發(fā)病，枝條發(fā)病死亡的扦插苗多散發(fā)惡臭，而且鏡檢時多檢測不到孢子，表明導致扦插苗死亡的可能主要是細菌性病害。

插穗的生理狀態(tài)不同，對扦插成活率也存在顯著影響。幼嫩插穗很難成活，常在3～5 d內(nèi)就腐爛死亡，生根成活率僅約1%左右。然而衰老植株，如“花打頂”的植株，插穗同樣不容易生根，在扦插后2周左右葉片枯黃死亡，生根存活率也常低于5%。只有健壯的枝條容易生根存活，常在1～2周內(nèi)生根存活，生根成活率可以超過50%。

2.3 利用水扦插苗進行枯萎病抗性鑒定可行性分析

試驗發(fā)現(xiàn)，水扦插生根成活苗接種黃瓜枯萎病原菌后出現(xiàn)了病征。從第3天起，其不定根基部開始變褐色，在第5～7天莖表面出現(xiàn)明顯褐色，同時葉片萎蔫，漸漸干枯死亡。鏡檢扦插苗的不定根及莖基部的維管束，只檢查到少量的大型或小型分生孢子，未發(fā)現(xiàn)大量菌絲?？?、感品種在發(fā)病時間和鏡檢分生孢子在莖基部維管束中擴散速度的表現(xiàn)不同：感病品種發(fā)病時間較抗病品種短，同時感病品種鏡檢分生孢子在莖基部維管束中的擴散速度也較抗病品種快。在濕度恰當?shù)臈l件下，側枝存活的時間一般都在15～20 d，采用枯萎病接種鑒定僅需7～10 d即可。因此利用黃瓜側蔓扦插苗進行接種鑒定枯萎病抗性，可以節(jié)省大量資源。

3 結論與討論

試驗以清水為對照，用2種濃度的NAA和ABT溶液分別對插穗進行處理，結果得出不同濃度的2種生長調(diào)節(jié)劑均能促進插穗生根，而以ABT 1 mL/L處理效果最好。從試驗結果可得：黃瓜側蔓扦插的成活率和生根率都不高。影響其生根的因素目前尚不明確，可能和品種自身有關[11]，也可能與扦插使用的基質(zhì)[12]、生長調(diào)節(jié)劑[13]及環(huán)境有關，而且還可能與扦插液中的微量元素的種類和含量有關[14]，因此，要精確優(yōu)化側蔓扦插系統(tǒng)，還需要開展更加嚴格的試驗。

試驗發(fā)現(xiàn)，黃瓜側蔓扦插的效果受基質(zhì)的理化特性影響很大。黃瓜插穗在花泥和河沙2種基質(zhì)中均能生根，但在花泥中生根數(shù)量少而弱，而在河沙中根系相對生長旺盛。此外，花泥中的插穗易腐爛，成活率低，這與其疏松透氣性不同有關，而水插則易受扦插母本的帶菌情況及插條生理狀態(tài)的干擾。利用水扦插苗進行黃瓜枯萎病抗性鑒定研究，側枝存活的時間較枯萎病接種鑒定所需要時間長；同時抗、感品種在發(fā)病時間和鏡檢分生孢子在莖基部維管束中擴散速度的表現(xiàn)不同，因此利用黃瓜側蔓扦插苗進行接種鑒定枯萎病具有可行性。在透明的容器中進行側蔓水插，容易觀察到發(fā)根過程以及隨后的發(fā)病進程，因此，扦插再生蔬菜的病害抗性鑒定值得進一步研究開發(fā)。

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