手性農藥在紅曲菌發(fā)酵過程中的立體選擇性行為研究

劉銀蘭，陸躍樂，嘉曉勤

(浙江工業(yè)大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

手性農藥在紅曲菌發(fā)酵過程中的立體選擇性行為研究

劉銀蘭，陸躍樂，嘉曉勤

(浙江工業(yè)大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術，研究了手性農藥腈菌唑、己唑醇在紅曲菌液態(tài)發(fā)酵和紅曲酒釀造過程中的立體選擇性降解情況，以及對紅曲菌產酶(糖化酶、纖維素酶)和典型代謝產物(紅曲色素、桔霉素)的影響.結果表明，腈菌唑、己唑醇的對映異構體的降解速率基本一致，無選擇性降解現(xiàn)象發(fā)生.腈菌唑、己唑醇的外消旋體及對映異構體對紅曲菌產酶和代謝物呈現(xiàn)一定的差異性，其中，在5，0.5 mg/L己唑醇條件下，紅曲菌產酶及代謝物表現(xiàn)出顯著性變化，且(+)-己唑醇顯著性大于(-)-己唑醇，5 mg/L質量濃度下顯著性大于0.5 mg/L；在0.05 mg/L己唑醇條件下，紅曲菌產酶及次級代謝均不存在顯著性差異.此外，不同質量濃度的腈菌唑外消旋體及對映異構體對紅曲菌產酶及次級代謝也不存在顯著性影響.

紅曲菌；手性農藥；立體選擇性降解；酶活

目前，手性農藥占中國使用農藥的40%以上[1]，不同的對映異構體在生物代謝速率、生物活性、降解速率和毒理學等方面均存在不同程度的差異[2]，它們在植物、人和環(huán)境中可能會發(fā)生不同的轉化，從而對人和非靶生物產生不同的毒性[3-8].從食品和環(huán)境安全上來說，在對映異構體水平上研究手性農藥對映異構體立體選擇性行為已經迫在眉睫.

紅曲酒是一種以大米為主要原料，經紅曲菌、酵母菌等微生物發(fā)酵形成的特色飲品，由于含有莫那可林K、紅曲色素等活性成分使其具有一定的保健功效，深受消費者喜愛.但大米原料可能會受到農藥污染，導致發(fā)酵產品存在潛在的風險.腈菌唑(rac-MYC)和己唑醇(rac-HEX)屬于三唑類殺菌劑，分別有兩種對映異構體.它們作為葉面施用殺菌劑被用于谷物、水果和蔬菜等農作物[9]，通過抑制細胞色素P-450介導的氧化脫甲基反應，阻斷麥角甾醇的生物合成來阻止真菌菌絲的生長[10-12].腈菌唑和己唑醇在土壤、番茄、黃瓜、草莓、藻類、魚、水蚤、鼠和兔子等體內具有不同的降解速率[13-17]，但其在紅曲菌中的研究尚無報道，對映異構體對紅曲菌酶系和次級代謝物的影響也不清楚.筆者采用液相色譜和質譜聯(lián)用技術分析研究了手性農藥腈菌唑和己唑醇在紅曲菌發(fā)酵過程中立體選擇性降解行為，并從對映體水平研究手性農藥對映異構體對紅曲菌酶活和代謝物的影響差異.

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

外消體腈菌唑和己唑醇標準品(純度>99.0%)由農業(yè)部農藥檢定所提供；腈菌唑和己唑醇對映異構體(純度>98.0%)由大賽璐藥物手性技術(上海)有限公司提供；其余試劑均為分析純.

1.2 紅曲米

利用紫色紅曲菌MonascuspurpureusFM-4000固態(tài)發(fā)酵7 d，獲得釀造紅曲酒所用的紅曲米，糖化力為642.5 mg/(g·h)，酯化力為2.511 mg/mL，色素含量為2 076.5 U/g.

1.3 紅曲菌液態(tài)發(fā)酵和紅曲酒釀造過程

紅曲菌發(fā)酵液的農藥暴露質量濃度為700 mg/L，按體積分數(shù)為10%的接種量接種于裝液量100 mL/250 mL的三角瓶中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)7 d.

將1 kg糯米沖洗干凈后，浸泡于2 g/L腈菌唑和己唑醇丙酮溶液中，加入1 mL吐溫-80作為乳化劑，每0.5 h攪拌一次，浸泡過夜.第2天瀝干浸泡水，將糯米蒸熟、冷卻后放入5 L酒罐中，加入2.5 L水，1 g安琪黃酒專用酵母和100 g紅曲米封口，避光發(fā)酵35 d.

1.4 樣品分析

取5 mL紅曲菌發(fā)酵液或紅曲酒液樣品轉移至50 mL聚丙烯離心管中，于渦旋混合器上渦旋3 min.4 ℃，8 000 r/min離心30 min，0.22 μm濾膜過濾，取100 μL提取物用900 μL乙腈溶解，混合均勻后用于進一步液質聯(lián)用[18]分析.

1.5 標準曲線和方法驗證

用乙腈溶解逐級稀釋不同質量濃度(2.5，5，25，50，100，250，500 mg/L)的標準溶液，繪制質量濃度對峰面積的曲線并進行回歸分析，使用Microsoft Excel計算標準偏差(SD)和相對標準偏差(RSD)(RSD=(SD/mean)×100%).因發(fā)酵前后發(fā)酵基質物質種類變化較大，故在不同時間點進行添加回收試驗(每個單體質量濃度為0.5，5，50 mg/L).最小檢出限(LOD)為檢測實際樣本時儀器3 倍信噪比；最低定量限(LOQ)為檢測實際樣本時儀器10 倍信噪比.

1.6 測定不同濃度下的酶活性

在不同時間點(1，3，5，7 d)進行發(fā)酵液取樣.樣品4 ℃，8 000 r/min離心20 min，在上清中緩慢加入不同飽和濃度的硫酸銨分級沉淀，去上清，沉淀重懸于50 mmol/L PBS緩沖液中，經透析袋去鹽后，裝入截留分子量為3 kDa超濾管中濃縮，收集粗酶液，檢測糖化酶和纖維素酶[19]的酶活.糖化酶酶活單位(U)定義：在40 ℃，pH=4.6條件下，每3 min水解淀粉生成1 mg還原糖所需的酶量為1 U；纖維素酶酶活單位(U)定義：在30 ℃，pH=4.6條件下，每3 min水解羧甲基纖維素鈉生成1 mg還原糖所需的酶量為1 U.紅曲菌發(fā)酵液取樣后，8 000 r/min離心20 min，取上清液，測定紅曲色素產量和桔霉素含量[20].

2 結果與討論

2.1 標準曲線和方法驗證

質量濃度為2.5～500 mg/L時，腈菌唑和己唑醇的對映異構體呈良好的線性關系(R2≥0.997).在此色譜條件下，外消旋腈菌唑和己唑醇完全拆分，且出峰位置無雜質干擾.

分別在0，3，7 d和0，14，35 d對空白紅曲菌液態(tài)發(fā)酵、紅曲酒樣本進行添加回收試驗，其回收率分別為(96.8±3.9)%～(99.8±2.2)%，(93.2±3.8)%～(99.8±2.0)%；RSD分別為2.1%～4.2%，2.0%～4.2%(表1).在此過程中，腈菌唑和己唑醇兩個對映異構體的最小檢出限為0.001 mg/L，最低定量限為0.005 mg/L，滿足該試驗要求.本試驗方法的回收率為70%～110%，RSD<15%.因此，本方法可適用于此發(fā)酵過程中腈菌唑和己唑醇對映異構體的含量分析.

表1 腈菌唑和己唑醇兩個對映異構體的添加回收率Table 1 Recoveries of the enantiomers of MYC and HEX in the fermention samples

注：1) 回收率表示平均回收率±SD(n=3).

2.2 腈菌唑和己唑醇的立體選擇性降解研究

隨著時間的變化，腈菌唑和己唑醇對映異構體的殘留情況如圖1所示，腈菌唑和己唑醇對映異構體的濃度變化及其趨勢基本一致.在紅曲菌液態(tài)發(fā)酵過程中，腈菌唑和己唑醇對映異構體一直有明顯的降解現(xiàn)象，(+)-R-MYC，(-)-S-MYC，(+)-R-HEX與(-)-S-HEX分別降解了23.06%，23.42%，16.00%，15.67%，模擬兩者的降解曲線，并獲得較好的相關系數(shù)(R2≥0.993)，(+)-R-MYC，(-)-S-MYC，(+)-R-HEX和(-)-S-HEX的半衰期分別為3.355，3.455，6.681，6.696 d，可見(+)-R-MYC，(+)-R-HEX的降解速度均稍高于(-)-S-MYC，(-)-S-HEX.在紅曲酒釀造過程中，腈菌唑濃度前5 d一直呈上升趨勢，可能是酒液處于吸收狀態(tài)，之后直至35 d，僅有少量腈菌唑和己唑醇被降解，(+)-R-MYC，(-)-S-MYC，(+)-R-HEX與(-)-S-HEX分別降解了13.85%，13.39%，39.24%，37.29%.同時，計算EF值均接近0.5.可見腈菌唑和己唑醇對映異構體未發(fā)生立體選擇性降解.

圖1 腈菌唑和己唑醇在紅曲菌液態(tài)發(fā)酵和紅曲酒釀造中的質量濃度變化趨勢圖Fig.1 Degradation linear of MYC and HEX enantiomers in the submerged fermentation of Monascus and in the Monascus wine

2.3 手性農藥對紅曲菌糖化酶活性影響差異

在紅曲菌液態(tài)發(fā)酵中，對照空白樣本，3 個濃度的腈菌唑和己唑醇外消旋體及其對映異構體對糖化酶有一定影響(圖2).在手性農藥質量濃度為5 mg/L時，腈菌唑和己唑醇對糖化酶有抑制作用，其中(+)-R-MYC，(+)-R-HEX及(-)-S-HEX對糖化酶有較強的抑制作用，采用SPSS軟件進行方差分析，己唑醇兩個對映異構體對糖化酶的影響有顯著性差異(P<0.05)，且(+)-R-HEX顯著性大于(-)-S-HEX；在質量濃度為0.5 mg/L時，rac-HEX，rac-MYC，(+)-R-HEX，(-)-S-HEX使得糖化酶酶活升高，說明手性農藥對糖化酶有激活作用，分析表明己唑醇兩個對映異構體對糖化酶的影響有顯著性差異(P<0.05)，且(+)-R-HEX顯著性大于(-)-S-HEX；在質量濃度為0.05 mg/L時，手性農藥對糖化酶酶活性的影響與對照組基本一致，不受兩個農藥外消旋體及對映體的影響.

圖2 腈菌唑和己唑醇及其對映異構體在不同質量濃度下對糖化酶酶活的影響Fig.2 The impact of different concentrations of test pesticides and their enantiomers on glucoamylase

2.4 手性農藥對紅曲菌纖維素酶活性影響差異

在紅曲菌液態(tài)發(fā)酵中，從圖3可知：在手性農藥質量濃度為5 mg/L時，手性農藥對纖維素酶酶活有一定的抑制作用，酶活均小于對照組，rac-MYC，(+)-R-MYC，(-)-S-MYC，(+)-R-HEX和(+)-R-HEX對纖維素酶有較強的抑制作用.用SPSS軟件數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，酶活相比對照組有顯著性差異(P<0.05)，且(+)-R-HEX顯著性大于(-)-S-HEX；在質量濃度為0.5 mg/L時，酶活有所上升，且都大于對照組，用軟件分析表明有顯著性差異(P<0.05)，且(+)-R-HEX顯著性大于(-)-S-HEX；在0.05 mg/L時，纖維素酶酶活性與對照組基本一致，不受兩個農藥外消旋體及對映體的影響.

圖3 腈菌唑和己唑醇及其對映異構體在不同質量濃度下對纖維素酶酶活的影響Fig.3 The impact of different concentrations of test pesticides and their enantiomers on cellulase

2.5 手性農藥對紅曲菌色價影響差異

在紅曲菌液態(tài)發(fā)酵中，與空白樣本對照(圖4)，3 個濃度的腈菌唑和己唑醇外消旋體及其對映異構體對色價有不同程度的抑制作用.隨著手性農藥添加質量濃度逐步增大，手性農藥對色價有強烈的抑制作用，尤其rac-HEX，(+)-R-HEX，(-)-S-HEX及(-)-S-MYC對色價影響更為明顯，通過SPSS軟件數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，相比對照組色價間均有顯著性差異(P<0.05)，且(+)-R-HEX顯著性大于(-)-S-HEX.

圖4 腈菌唑和己唑醇及其對映異構體在不同質量濃度下對色價的影響Fig.4 The impact of different concentrations of test pesticides and their enantiomers on color value

2.6 手性農藥對紅曲菌桔霉素產量的影響差異

在紅曲菌液態(tài)發(fā)酵中，對照空白樣本，3 個濃度的腈菌唑和己唑醇外消旋體及其對映異構體對桔霉素質量濃度有一定影響(圖5).隨著手性農藥添加質量濃度逐漸升高，桔霉素的質量濃度出現(xiàn)不同程度的增加趨勢，其中rac-HEX對桔霉素質量濃度的影響極其明顯，通過SPSS軟件數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)相比對照組有顯著性差異(P<0.05)，且(+)-R-HEX顯著性大于(-)-S-HEX，而導致出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，可能與rac-HEX對細胞的毒副作用較大有關.

圖5 腈菌唑和己唑醇及其對映異構體在不同質量濃度下對桔霉素質量濃度的影響Fig.5 The impact of different concentrations of test pesticides and their enantiomers on citrinin

3 結 論

上述試驗的研究發(fā)現(xiàn)，腈菌唑和己唑醇的對映異構體在紅曲菌發(fā)酵過程中都有一定程度的降解，且降解速率基本一致，均小于50%，可見腈菌唑和己唑醇在發(fā)酵過程中殘留時間較長，并一直殘留至最終的產品中，可能會對消費者構成潛在的風險.而手性農藥殘留對紅曲菌酶活性存在不同程度的影響，對映異構體之間存在不同的差異性，且(+)-己唑醇顯著性大于(-)-己唑醇.筆者研究了手性農藥腈菌唑和己唑醇的不同對映異構體立體選擇性降解和生物活性情況，為今后評估環(huán)境風險和人類健康安全提供一定的參考.

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(責任編輯：朱小惠)

Stereoselective behaviors of chiral pesticide in theMonascusfermentation process

LIU Yinlan, LU Yuele，JIA Xiaoqin

(College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

The stereoselective degradation of myclobutanil and hexaconazole in the submerged fermentation ofMonascusandMonascuswine brewing process were analyzed by HPLC-MS/MS, and the effects of enantiomers on enzyme (glucoamylase, cellulose) and secondary metabolites (Monascuspigment, citrinin) ofMonascuswere investigated. The results showed that the degradation rate of two enantiomers of myclobutanil and hexaconazole was similar, and no stereoselective degradation was found. The racemates and enantiomers of myclobutanil and hexaconazole showed certainly differences in the enzyme production and metabolism ofMonascus. At a concentration of 5 and 0.5 mg/L of racemates and enantiomers of hexaconazole, respectively, the enzyme production and metabolites changed significantly, with (+)-hexoxazole higher than (-)-hexaconazole. However, at 0.05 mg/L of racemates and enantiomers of hexaconazole, no significant changes occurred. In addition, there was also no significant difference between racemates and enantiomers at different concentrations of myclobutanil.

Monascus; chiral pesticide; stereoselective degradation; enzymatic activity

2017-02-28

國家文物局指南針計劃項目(20130306)

劉銀蘭(1990—)，女，河南開封人，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程，E-mail：liuyinlan0215@163.com. 通信作者：嘉曉勤副教授，E-mail: monascus@zjut.edu.cn.

Q815

A

1674-2214(2017)02-0092-08