• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    補腎健脾中藥復方對骨質疏松骨折骨痂中CTGF、Osterix因子表達的影響

    2017-07-05 23:10:22龔輝松
    中國當代醫(yī)藥 2017年13期

    龔輝松

    [摘要]目的 分析補腎健脾中藥復方對骨質疏松骨折骨痂中CTGF、Osterix因子表達的影響。方法 選擇6月齡清潔級健康雌性SD大鼠60只,隨機分為3組:模型組、西藥組和中藥組,每組20只。骨質疏松骨折模型成功后,中藥組和西藥組分別給予補腎健脾中藥復方和阿倫磷酸鈉混懸液灌服,模型組進行常規(guī)培養(yǎng),1個月后取各組骨折的骨痂,進行體外培養(yǎng),各組骨痂給予對應含藥血清進行培養(yǎng)。采用熒光定量PCR法檢測各組CTGF、Osterix因子的表達。結果 在CTGF表達方面,中藥組和西藥組中的CTGF mRNA含量明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);在Osterix表達方面,中藥組和西藥組中的Osterix mRNA含量明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且中藥組的Osterix mRNA含量高于西藥組(P<0.05)。結論 補腎健脾中藥復方能在一定程度上促進骨痂的生長,從而促進骨折愈合,為骨質疏松性骨折愈合的機制和防治方法提供了一種新的途徑。

    [關鍵詞]補腎健脾中藥;骨質疏松骨折;骨痂;結締組織生長因子;Osterix

    [中圖分類號] R683 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721(2017)05(a)-0063-04

    [Abstract]Objective To analyze the influence of Chinese Herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen on CTGF and Osterix factor expression in callus of osteoporotic fracture.Methods 60 female SD rats of clean-class aged six-month were selected and they were randomly divided into 3 groups:model group,western medicine group and traditional Chinese medicine group (TCM group) (n=20).After the success of the osteoporosis′ fracture model,TCM group was given Chinese Herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen and the western medicine group was given sodium alendate suspension.The model group was given routine culture.After 1 month,the callus of each group was taken and cultured in vitro.The callus of each group was cultured with the corresponding serum.CTGF and Osterix expression in each group were detected by fluorescence quantitative PCR.Results The expression of CTGF mRNA in TCM group and western medicine group was significantly higher than that in model group (P<0.05).Osterix mRNA level in TCM group and western medicine group were significantly higher than those in model group (P<0.05),and the content of Osterix mRNA in TCM group was higher than that in western medicine group (P<0.05).Conclusion Chinese herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen can promote the growth of callus to a certain extent,thus promote fracture healing,and it provides the new way for the mechanism and prevention and treatment methods osteoporosis′fracture healing.

    [Key words]Chinese herbal medicine of tonifying kidney and strengthening spleen;Osteoporosis fracture;Callus;Connective tissue growth factor;Osterix

    骨質疏松癥最嚴重的并發(fā)癥是骨質疏松性骨折,嚴重影響患者的生活質量。骨質疏松性骨折是由于骨強度下降所致。目前已知的影響骨強度的因素主要有骨量、骨微結構、骨的幾何形狀、皮質骨厚度和多孔程度、骨組織構成材料的內在性能等[1]。骨質疏松性骨折的防治已成為了全世界關注的課題。然而,目前國內外對骨質疏松性骨折愈合機制以及對骨質疏松性骨折局部骨痂的“質量”的研究相對較少,且主要針對體內環(huán)境中的骨痂進行探討。本研究通過建立骨質疏松性骨折模型及骨痂組織體外培養(yǎng)體系,運用中藥血清藥理學的研究方法,模擬中藥在體內作用于骨痂組織的模式,觀察補腎健脾中藥復方對體外環(huán)境中骨痂生物學特性的變化以及結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Osterix因子表達的影響,揭示補腎健脾中藥復方對骨質疏松性骨折骨痂生物學特性影響的作用機制,為中醫(yī)“腎主骨”理論提供實驗依據。亦為研究骨質疏松性骨折愈合的生理病理機制和治療方法提供一種新的思維模式。

    1材料與方法

    1.1試驗動物

    6月齡清潔級健康雌性SD大鼠60只,其體重為(260±30)g。隨機分為3組:模型組、西藥組和[l1]中藥組;每組20只。所有動物均為廣州中醫(yī)藥大學動物中心提供。

    1.2實驗藥物

    中藥組采用補腎健脾中藥復方灌服,藥物的主要組成包括:黃芪12 g,補骨脂15 g,淫羊藿15 g,菟絲子12 g,肉蓯蓉15 g,熟地15 g,白芍10 g等組成。根據臨床用藥劑量及新藥研究中動物用藥劑量要求,該方的提取藥物,含生藥量1.65 g/ml。西藥組采用阿倫磷酸鈉片配制成0.055 mg/ml濃度的阿倫磷酸鈉混懸液(杭州默沙東制藥有限公司提供,國藥準字J20080069)。

    1.3含藥血清的制備

    每組中10只大鼠給予相應的藥物連續(xù)灌胃2周,其中西藥組和中藥組以蒸餾水定容至上述所需濃度,每日灌胃1次,模型組給予正常飲食。最后1次給予動物灌胃后的2 h,對動物行心臟采血。獲得的全血置于含EDTA抗凝試管中,5~10 min后,以3000 r/min離心15 min,吸取上清,加以滅活,抽濾除菌,放置-20℃冰箱保存。

    1.4 動物造模

    每組中另外10只作動物模型,采用10%水合氯醛溶液作麻醉,以0.33 ml/100 g腹腔注射,待5 min后,大鼠麻醉完全,采用背側入路行雙側卵巢摘除術以造模。3個月后,行骨密度檢查,證實模型成功后,對各組麻醉,消毒右下肢,取膝內側髕旁切口約1 cm,逐層分離切開,將髕骨及韌帶向外側推開,暴露膝關節(jié),屈曲膝關節(jié),暴露髁間窩,鉆入0.5 mm克氏針,至股骨轉子下,做髓內固定,剪斷克氏針,殘端長度以不影響關節(jié)活動為度。利用骨折發(fā)生裝置將股骨造成閉合性骨折[2-3]。

    1.5給藥方法

    骨質疏松骨折的模型成功后,各組開始灌胃治療,灌胃給藥容積為10 ml/kg,模型組灌服蒸餾水;西藥組和中藥組以蒸餾水定容至上述所需濃度,每日灌胃1次,治療時間為1個月。

    1.6骨痂的體外培養(yǎng)

    摘取眼球取大鼠外周血3~4 ml,取血后處死,置于75%的乙醇浸泡15 min,置于無菌臺上,切開皮膚及皮下,分離肌肉,暴露骨折段,取出骨痂,PBS漂洗后放于Eppendorf管作備用。大鼠處死前24 h禁食。將新鮮骨痂標本切成1 mm×1 mm×1 mm大小,經過兩次含有青霉素及鏈霉素的PBS液漂洗后,放入培養(yǎng)板,加等量bGJB培養(yǎng)液,置于37℃,5%CO2中靜置培養(yǎng),24 h后換液,根據分組情況分別加用含藥血清與bGJB培養(yǎng)液共同培養(yǎng),1周后收集標本進行相關指標檢測。

    1.7 指標的檢測及結果的計算

    采用熒光定量PCR檢測各組骨痂中的CTGF 和 Osterix 的mRNA含量。使用引物和探針設計軟件Primer 5.0,除了考慮引物、探針設計的通用原則外,此引物Tm值要求在58~60℃,探針Tm值在68~70℃,以保證探針特異性雜交。序列表見表1。

    按照抽提的總RNA應馬上進行反轉錄:取2 μl RNA模板做逆轉錄反應,反轉錄反應程序:30℃ 10 min,42℃ 20 min,99℃ 5 min,4℃ 5 min;取1 μl反轉錄產物(cDNA)進行熒光定量PCR。根據實時熒光定量RT-PCR的原理,以β-actin基因mRNA的表達為內對照。ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(β-actin),然后計算實驗組各樣本的ΔCt與對照組樣本的ΔCt的差值,從而得到ΔΔCt,ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)。采用2-ΔΔCt進行計算。表示實驗組測定基因的表達相對于對照組樣本基因的表達的變化倍數,將2-ΔΔCt作為最后的定量結果用于統(tǒng)計分析。

    1.8統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 16.0軟件包分析,計量資料用x±s表示,采用方差分析和t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2結果

    在CTGF表達方面,中藥組和西藥組的CTGF mRNA含量明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但中藥組與西藥組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在Osterix表達方面,中藥組和西藥組的Osterix mRNA含量明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且中藥組的Osterix mRNA含量高于西藥組(P<0.05)(表2)。

    3討論

    中醫(yī)學認為骨質疏松屬“骨痿“范疇?!端貑枴ゐ粽摗吩疲骸按四四I水不足,水不勝火;則骨枯髓虛,故足不任身,發(fā)為骨痿?!逼洳∫虿C,當首責于腎虛。由于各種原因導致腎(氣、陰、陽)的不足,影響骨髓和血之化源,精不生髓,骨失髓血充養(yǎng),易發(fā)生骨骼脆弱無力之證,即骨質疏松性骨折。同時,中醫(yī)學亦認為骨質疏松性骨折愈合就是“瘀去、新生、骨合”的過程,且在“腎主骨”理論指導下進行組方用藥,國內的研究[4]表明補腎中藥提高了機體內分泌腺系統(tǒng)的功能,改善了下丘腦-垂體-性腺軸的功能,增加了體內的性激素,調整了內環(huán)境,從而達到抑制骨吸收,增加骨形成的目的,起到提高骨量的作用。魏合偉等[5-6]的研究已證明以“補腎法”擬定的中藥骨康方對骨代謝有雙向作用,既可抑制骨吸收,又可促進骨形成,縮短再造周期,提高骨生物力學性能,改善骨的質量,是一個較理想的治療骨質疏松癥的藥物。同時,發(fā)現其含藥血清中含有類性激素樣作用的物質;能促進成骨細胞增殖和礦化,并促進成骨細胞分泌Ⅰ型膠原。

    本研究所用方由黃芪、補骨脂、淫羊藿、菟絲子、肉蓯蓉、熟地、白芍等組成,全方諸藥共奏補腎壯骨、健脾益氣之功效。該方以補骨脂補腎助陽壯骨為君藥。輔之肉蓯蓉、淫羊藿、菟絲子加強其補腎壯陽之功為臣藥。同時配以黃芪補中益氣;熟地、白芍滋陰益精,培補后天生化之源以充腎精,又可達到補中寓通,補而不滯的目的,共為佐藥,故本方具有補腎壯骨、健脾益氣的作用。

    骨折修復的最終目的是盡可能恢復受傷骨的最大力學強度,修復骨折不僅要恢復骨形態(tài)的連續(xù),更重要的是重建骨的支撐功能[7]。骨痂被認為是一種黏彈性物質,會隨著骨愈合過程而發(fā)生變化,由此出現剛度與強度變化的不同步[8]。張勝利等[9]的研究表明,骨質疏松后,皮質骨和松質骨的生物力學性能均發(fā)生了改變:在骨折愈合的不同時期骨痂局部的形狀、截面積、均勻性等發(fā)生變化,對于骨質疏松骨折而言,骨皮質變薄,骨彈性下降,骨脆性增加,骨骼的生物力學性能下降。隨著分子生物學的發(fā)展,人們對骨折愈合的認識不斷深化,現已知有大量的細胞生長因子在骨折愈合的不同階段參與并調控了實質過程,如CTGF及Osterix因子對骨細胞的增殖和分化有重要作用。

    CTGF是CCN家族中的成員,是一種由349個氨基酸組成,分子量為34~38 KD的富含半胱氨酸的分泌肽,目前該家族共有CTGF/fisp-12,cef10/Cyr61和Nov三個成員,參與了體內的多種病理生理過程,在骨折愈合中發(fā)揮重要作用。研究表明[10-11],其可促進軟骨細胞、生長板軟骨細胞、肥大軟骨細胞的增殖,并參與膜內骨化和骨建?;蛑厮?,因此在維持骨量方面有重要作用。在本研究中,中藥組和西藥組的CTGF mRNA含量明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學與意義,說明補腎健脾中藥復方能進一步提高骨痂的生長。

    Osterix是一種含有鋅指結構的,對成骨細胞分化很重要的轉錄因子,屬于Sp/XKLF家族,定位局限于細胞核。它只在發(fā)育的骨組織中特異表達,被Lee等[12]認為是直接調節(jié)骨形成protein-2-runx2通路主要因子。另一方面,Osterix被認為是sox9和軟骨細胞的一種負向調控因子,可阻止骨或軟骨的祖細胞向軟骨細胞的分化。Baek等[13]的研究表明,Osterix失去可以延遲成骨細胞的成熟,導致不成熟的成骨細胞的積累和減少骨形成的成骨細胞功能的缺陷,無明顯骨吸收,因此,認為Osterix在積極調控成骨細胞分化和骨形成具有重要作用。Kang等[14]用機械牽張力結合超聲波刺激成骨細胞前體細胞,發(fā)現Osterix結合機械刺激可加速成骨細胞的基質成熟。Sinha等[15]認為,Osterix是成骨細胞特異性轉錄因子,它能激活早期成骨細胞分化成更多成熟的骨細胞。在本研究中,中藥組和西藥組中的Osterix mRNA含量明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義,且中藥組的Osterix mRNA含量高于西藥組,差異有統(tǒng)計學意義,說明補腎健脾中藥復方在提高骨痂的生長有明顯的影響。

    綜上所述,補腎健脾中藥復方能在一定程度上可促進骨痂的生長,從而促進骨折愈合,為防治骨質疏松性骨折、促進骨折愈合的治療方法提供了一種新的途徑。

    [參考文獻]

    [1]Fonseca H,Moreira-Gon?觭alves D,Coriolano HJ,et al.Bone quality:the determinants of bone strength and fragility[J].Sports Med,2014,44(1):37-53.

    [2]程英雄,羅毅文,趙可偉,等.補腎健脾活血法對SD大鼠骨折愈合過程中骨痂顯微結構變化的影響[J].新中醫(yī),2010, 42(8):126-127.

    [3]周曉中,董啟榕,張健.大鼠股骨閉合骨折模型的制作[J].東南大學學報(醫(yī)學版),2007,26(1):60-62.

    [4]李穎,白波,吳伙燕,等.補腎健脾中藥復方對去勢大鼠血清中Bcl-2和Bax水平的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012, 27(4):1120-1123.

    [5]魏合偉,林一峰.中藥骨康含藥血清中類雌二醇樣物質含量的測定[J].中醫(yī)正骨,2003,15(11):14-16.

    [6]李穎,黃宏興,莊洪,等.中藥骨康對去勢大鼠骨質疏松作用機制的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2009,24(2):160-163.

    [7]夏群,苗軍,張繼東,等.周圍神經系統(tǒng)對骨折愈合影響的實驗研究[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2003,5(3):233-235.

    [8]賀小兵,盧衛(wèi)忠,唐康來,等.骨形成蛋白和轉化生長因子-β對兔尺骨骨折愈合后生物力學性能的影響[J].中國修復重建外科雜志,2003,17(3):2185-2188.

    [9]張勝利,王全平.骨質疏松性骨折愈合過程中骨痂局部生物力學改變的實驗研究[J].西安醫(yī)科大學學報,2001,22(6):558-560.

    [10]Takigawa M,Nakanishi T,Kubota S,et al.Role of CTGF/HCS24/ecogenin in skeletal growth control[J].J Cell Physiol,2003,194(3):256-266.

    [11]Tsai HC1,Su HL,Huang CY,et al.CTGF increases matrix metalloproteinases expression and subsequently promotes tumor metastasis in human osteosarcoma through down-regula?鄄ting miR-519d[J].Oncotarget,2014,5(11):3800-3812.

    [12]Lee DS,Choung HW,Kim HJ,et al.NFI-C Regulates Osteo?鄄blast Differentiation via Control of Osterix Expression[J].Stem Cells,2014,32(9):2467-2679.

    [13]Baek WY,Lee MA,Jung JW,et al.Positive regulation of adult bone formation by osteoblast-specific transcription factor osterix[J].J Bone Miner Res,2009,24(6):1055-1065.

    [14]Kang KS,Lee SJ,Lee HS,et al.Effects of combined mechanical stimulation on the proliferation and differe?鄄ntiation of pre-osteoblasts[J].Exp Mol Med,2011,43(6):367-373.

    [15]Sinha KM,Zhou X.Genetic and molecular control of osterix in skeletal formation[J].J Cell Biochem,2013,114(5):975-984.

    (收稿日期:2017-03-08 本文編輯:許俊琴)

    69精品国产乱码久久久| 欧美人与善性xxx| videos熟女内射| 中文字幕亚洲精品专区| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品一区蜜桃| 一区福利在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看 | 日韩av在线免费看完整版不卡| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 午夜免费观看性视频| 黄频高清免费视频| 亚洲综合色网址| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久久久久久大尺度免费视频| 熟女av电影| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲免费av在线视频| 在线观看免费高清a一片| 又紧又爽又黄一区二区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品一区在线观看国产| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一级毛片 在线播放| xxx大片免费视频| 欧美大码av| 99国产精品99久久久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲专区国产一区二区| 婷婷成人精品国产| 国产免费又黄又爽又色| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 精品国产一区二区久久| 真人做人爱边吃奶动态| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 黄色一级大片看看| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久99热这里只频精品6学生| 另类精品久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 欧美久久黑人一区二区| 欧美成人午夜精品| 丁香六月天网| 美女午夜性视频免费| 两个人免费观看高清视频| 深夜精品福利| 大陆偷拍与自拍| 久久免费观看电影| 日本wwww免费看| 午夜福利视频精品| 涩涩av久久男人的天堂| 国产成人精品久久二区二区91| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产精品人妻久久久影院| 我要看黄色一级片免费的| 在线观看人妻少妇| cao死你这个sao货| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲三区欧美一区| 九草在线视频观看| 99热网站在线观看| 一本久久精品| 午夜免费观看性视频| 久久免费观看电影| 一区二区三区四区激情视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 午夜福利,免费看| 成年人黄色毛片网站| 黄色a级毛片大全视频| 国产精品久久久久久精品古装| www.999成人在线观看| 日本av免费视频播放| 久久99热这里只频精品6学生| 午夜视频精品福利| 丝袜美腿诱惑在线| 男女国产视频网站| 妹子高潮喷水视频| 久久国产精品大桥未久av| 久久九九热精品免费| 免费看十八禁软件| 亚洲国产精品国产精品| 新久久久久国产一级毛片| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品国产av在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 老司机在亚洲福利影院| 亚洲少妇的诱惑av| 男女之事视频高清在线观看 | 99久久人妻综合| 国产成人精品在线电影| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久久精品区二区三区| 成人免费观看视频高清| 中文字幕色久视频| 午夜激情av网站| kizo精华| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| av不卡在线播放| 亚洲国产看品久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产成人a∨麻豆精品| av在线app专区| 免费观看av网站的网址| 搡老乐熟女国产| 999精品在线视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 97人妻天天添夜夜摸| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲国产av新网站| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产伦理片在线播放av一区| 桃花免费在线播放| 久久人人爽人人片av| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产极品粉嫩免费观看在线| 婷婷色综合www| 美女中出高潮动态图| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 青青草视频在线视频观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 男女下面插进去视频免费观看| 国产高清国产精品国产三级| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品久久蜜臀av无| 亚洲精品国产区一区二| 国产成人精品在线电影| 男女国产视频网站| 成年av动漫网址| 欧美xxⅹ黑人| 欧美大码av| 999久久久国产精品视频| 欧美日韩综合久久久久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 又紧又爽又黄一区二区| 成人亚洲精品一区在线观看| www.熟女人妻精品国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜久久久在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 深夜精品福利| bbb黄色大片| 久久久久久久精品精品| 一级毛片电影观看| 亚洲欧洲国产日韩| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲精品日本国产第一区| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品一国产av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 啦啦啦 在线观看视频| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产一卡二卡三卡精品| 美女主播在线视频| 99九九在线精品视频| 日韩视频在线欧美| 成年人黄色毛片网站| 午夜91福利影院| avwww免费| 亚洲美女黄色视频免费看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 午夜两性在线视频| 丝袜美腿诱惑在线| 久久青草综合色| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久av网站| 性少妇av在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产高清不卡午夜福利| 黄色怎么调成土黄色| 老熟女久久久| 视频在线观看一区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www| 国产视频一区二区在线看| 十八禁网站网址无遮挡| 国产男女内射视频| 国产深夜福利视频在线观看| 成人手机av| 亚洲国产最新在线播放| 一二三四社区在线视频社区8| 女人精品久久久久毛片| 午夜视频精品福利| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品日本国产第一区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 悠悠久久av| 久久精品国产亚洲av高清一级| 日本av手机在线免费观看| 国产成人系列免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一区二区三区乱码不卡18| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 91老司机精品| 国产99久久九九免费精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 中文字幕av电影在线播放| 美女中出高潮动态图| 日韩伦理黄色片| 午夜激情av网站| 视频区欧美日本亚洲| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲av在线观看美女高潮| 最新的欧美精品一区二区| 丰满少妇做爰视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲av男天堂| 久久精品久久久久久久性| 51午夜福利影视在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 天天影视国产精品| 日韩制服骚丝袜av| 少妇粗大呻吟视频| 日韩大码丰满熟妇| 下体分泌物呈黄色| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲第一青青草原| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产成人影院久久av| 亚洲欧美清纯卡通| 成年人免费黄色播放视频| 高清av免费在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 中文欧美无线码| a级毛片黄视频| 看十八女毛片水多多多| 国产99久久九九免费精品| 精品人妻在线不人妻| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 男女下面插进去视频免费观看| 久久 成人 亚洲| 免费看不卡的av| 十分钟在线观看高清视频www| 老汉色∧v一级毛片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 色婷婷久久久亚洲欧美| 中文字幕人妻丝袜制服| 丰满少妇做爰视频| 久久久国产精品麻豆| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久热这里只有精品99| 女人精品久久久久毛片| 乱人伦中国视频| 亚洲五月婷婷丁香| 久久久久国产精品人妻一区二区| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲av片天天在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 一级片'在线观看视频| 韩国精品一区二区三区| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲五月色婷婷综合| 日本a在线网址| 美女福利国产在线| 男女床上黄色一级片免费看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久久久欧美国产精品| 一本色道久久久久久精品综合| 飞空精品影院首页| 后天国语完整版免费观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美激情极品国产一区二区三区| xxxhd国产人妻xxx| 高清视频免费观看一区二区| 国产一区二区 视频在线| 搡老岳熟女国产| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 日韩一本色道免费dvd| 一本综合久久免费| 最近中文字幕2019免费版| 一区二区三区四区激情视频| 国产在线视频一区二区| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 人体艺术视频欧美日本| 777米奇影视久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产在线免费精品| 国产麻豆69| 99久久综合免费| 97在线人人人人妻| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久久久久久久久久大奶| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产又色又爽无遮挡免| 国产欧美日韩综合在线一区二区| netflix在线观看网站| 精品一区二区三卡| 成年人黄色毛片网站| 99国产精品99久久久久| 成人国产一区最新在线观看 | av在线播放精品| 男女午夜视频在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲伊人色综图| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国精品久久久久久国模美| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 亚洲欧洲日产国产| 999精品在线视频| 中文字幕人妻丝袜制服| av一本久久久久| 亚洲成人免费电影在线观看 | 亚洲国产最新在线播放| 精品人妻在线不人妻| 久9热在线精品视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产精品成人在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲成人免费av在线播放| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲av片天天在线观看| 考比视频在线观看| 成人国语在线视频| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品人妻久久久影院| 国产亚洲精品第一综合不卡| 首页视频小说图片口味搜索 | 夫妻午夜视频| 日本欧美视频一区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 五月开心婷婷网| 国产av国产精品国产| 欧美黑人欧美精品刺激| 天堂8中文在线网| 亚洲第一青青草原| 黄色怎么调成土黄色| 99re6热这里在线精品视频| 人人澡人人妻人| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲,一卡二卡三卡| 啦啦啦 在线观看视频| 国产av国产精品国产| 九草在线视频观看| 亚洲国产欧美网| 久久女婷五月综合色啪小说| netflix在线观看网站| 黑丝袜美女国产一区| 99久久综合免费| 亚洲人成77777在线视频| 伊人亚洲综合成人网| 免费日韩欧美在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品一区二区精品视频观看| 又大又爽又粗| 亚洲精品国产区一区二| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精品国产乱码久久久久久小说| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 99热国产这里只有精品6| 999久久久国产精品视频| 国产成人av教育| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 999久久久国产精品视频| 国产国语露脸激情在线看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 首页视频小说图片口味搜索 | 黄片播放在线免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲,欧美精品.| 日本午夜av视频| 人人妻人人澡人人看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲色图综合在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 后天国语完整版免费观看| 成年人午夜在线观看视频| 成人免费观看视频高清| 激情五月婷婷亚洲| 日本91视频免费播放| 后天国语完整版免费观看| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美人与善性xxx| 亚洲国产中文字幕在线视频| av线在线观看网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产在视频线精品| 亚洲久久久国产精品| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 日本av免费视频播放| 日本欧美国产在线视频| 亚洲人成77777在线视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 人妻 亚洲 视频| 女人精品久久久久毛片| 9热在线视频观看99| 欧美激情高清一区二区三区| 热re99久久国产66热| 国产伦理片在线播放av一区| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美+亚洲+日韩+国产| 香蕉国产在线看| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲精品自拍成人| 欧美日韩精品网址| 黑丝袜美女国产一区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品一品国产午夜福利视频| 一本色道久久久久久精品综合| 午夜精品国产一区二区电影| 伊人亚洲综合成人网| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 少妇精品久久久久久久| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日本欧美国产在线视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲色图综合在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产激情久久老熟女| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 高清视频免费观看一区二区| 中文字幕最新亚洲高清| 国产主播在线观看一区二区 | 水蜜桃什么品种好| 男女免费视频国产| av国产久精品久网站免费入址| 国产一区二区激情短视频 | 脱女人内裤的视频| 18禁国产床啪视频网站| √禁漫天堂资源中文www| 国产真人三级小视频在线观看| 操美女的视频在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 麻豆国产av国片精品| 性色av一级| 大香蕉久久成人网| 99热全是精品| 老鸭窝网址在线观看| 午夜日韩欧美国产| 五月开心婷婷网| 免费在线观看日本一区| 免费在线观看完整版高清| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲人成网站在线观看播放| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产高清视频在线播放一区 | 免费不卡黄色视频| 十八禁高潮呻吟视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美日韩亚洲高清精品| 后天国语完整版免费观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲人成电影观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久久久久久久久久久大奶| 成年人午夜在线观看视频| 国产熟女欧美一区二区| 美国免费a级毛片| 丝袜美腿诱惑在线| 日日夜夜操网爽| 大香蕉久久网| 亚洲成人手机| www.av在线官网国产| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲情色 制服丝袜| 精品人妻在线不人妻| 国产片内射在线| avwww免费| 多毛熟女@视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲精品国产一区二区精华液| 热re99久久精品国产66热6| 免费人妻精品一区二区三区视频| 水蜜桃什么品种好| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 日韩av不卡免费在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 最近手机中文字幕大全| 欧美激情高清一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 国产有黄有色有爽视频| 最近手机中文字幕大全| 免费观看人在逋| 国产精品久久久久成人av| 性色av乱码一区二区三区2| 我要看黄色一级片免费的| 天堂中文最新版在线下载| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 在线观看一区二区三区激情| 国产一区亚洲一区在线观看| 日本欧美视频一区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久久久国产电影| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产精品久久久av美女十八| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产真人三级小视频在线观看| av网站在线播放免费| 在线观看免费视频网站a站| 国产高清videossex| 99国产精品免费福利视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 色94色欧美一区二区| 91精品国产国语对白视频| 老司机影院毛片| 老司机影院成人| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲av综合色区一区| 少妇人妻 视频| 久久精品国产a三级三级三级| 爱豆传媒免费全集在线观看| 天天影视国产精品| 欧美中文综合在线视频| 国产午夜精品一二区理论片| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产av国产精品国产| 免费高清在线观看日韩| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 18在线观看网站| 丝袜在线中文字幕| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品久久蜜臀av无| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 伦理电影免费视频| 亚洲久久久国产精品| 国产免费视频播放在线视频| 人体艺术视频欧美日本| 五月天丁香电影| 久久精品成人免费网站| 性色av一级| 女警被强在线播放| 在线观看人妻少妇| 日韩av免费高清视频| 考比视频在线观看| 国产成人av激情在线播放| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲精品国产av成人精品| 美女大奶头黄色视频| 亚洲av综合色区一区| 少妇人妻 视频| tube8黄色片| 免费av中文字幕在线| 亚洲,欧美,日韩| 热re99久久国产66热| 久久人妻熟女aⅴ| 91九色精品人成在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 老司机在亚洲福利影院| 欧美日韩成人在线一区二区| 中文字幕亚洲精品专区| 一级毛片 在线播放| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美久久黑人一区二区| 国产免费现黄频在线看| 日本欧美国产在线视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 久久久精品免费免费高清| 精品少妇久久久久久888优播| 国产高清不卡午夜福利| 手机成人av网站| 后天国语完整版免费观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 免费在线观看影片大全网站 | a 毛片基地| 后天国语完整版免费观看| 国产日韩欧美亚洲二区| √禁漫天堂资源中文www| 欧美日本中文国产一区发布| 一本久久精品| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 美女视频免费永久观看网站| 免费不卡黄色视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 天堂8中文在线网| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 男人爽女人下面视频在线观看|