Th1、Th2和Th17細胞失衡與克羅恩病的關系*

夏盛隆 薛戰(zhàn)雄 蔡振寨 夏宣平 湯一冰 蔣 益&

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科1(325000) 病理科2

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Th1、Th2和Th17細胞失衡與克羅恩病的關系*

夏盛隆1#薛戰(zhàn)雄1蔡振寨1夏宣平1湯一冰2蔣 益1&

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科1(325000) 病理科2

背景：免疫功能紊亂是炎癥性腸病發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)Th1、Th2和Th17細胞比例失衡與腸道免疫失調(diào)相關。目的：探討Th1、Th2和Th17細胞失衡與克羅恩病(CD)的關系。方法：收集2013年1月—2014年12月溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院收治的CD患者36例，同期行腸息肉摘除術患者40例作為對照組，分別取病變部位腸組織和正常腸組織，采用real-time PCR和免疫組化法檢測Th1、Th2、Th17細胞相關轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、GATA-3、RORγt)和細胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-17A)表達。結果：與對照組相比，CD組腸組織中T-bet、RORγt mRNA表達、IFN-γ、IL-17A mRNA和蛋白表達以及代表Th1/Th2、Th17/Th2比例的T-bet/GATA-3、RORγt/GATA-3比值均顯著增高(P<0.05)，各轉(zhuǎn)錄因子與相應細胞因子表達呈顯著正相關(P<0.05)。IFN-γ和IL-17A免疫陽性物質(zhì)均定位于細胞質(zhì)，在CD患者中陽性細胞主要分布于上皮層和黏膜固有層。分層分析顯示活動期CD的上述指標均顯著高于緩解期(P<0.05)；活動期CD代表Th17/Th1比例的RORγt/T-bet比值亦較緩解期顯著增高(P<0.05)。結論：腸組織中Th1、Th2和Th17細胞失衡與CD密切相關，Th1、Th17細胞極化可能在其中起重要作用，活動期CD以Th17細胞極化為著。

Crohn病； Th1細胞； Th2細胞； Th17細胞

傳統(tǒng)觀點認為克羅恩病(Crohn’s disease, CD)主要是由Th1型免疫反應介導，與Th2細胞分泌的白細胞介素-4(IL-4)、IL-5、IL-13等細胞因子無關。近年來，隨著Th17細胞的發(fā)現(xiàn)，一些學者提出Th17細胞極化可能是炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機制之一[1-2]，但亦存在不同觀點[3]。如有研究發(fā)現(xiàn)，以IL-17A抗體拮抗Th17細胞功能非但不能誘導CD臨床緩解，還可能導致炎癥進展[4]；經(jīng)治療獲得臨床緩解的CD患者，外周血Th17細胞比例反而顯著高于活動期[5]。一項對德國IBD患者的研究[6]顯示，在活動期IBD患者炎癥黏膜中特異性聚集的Th17細胞兼有Th1細胞特性[干擾素-γ(IFN-γ)+IL-17+CD4+T細胞]。對意大利CD患者的研究[7]發(fā)現(xiàn)，病程較長的CD患者病變腸黏膜中Th1、Th2、Th17型細胞因子表達均顯著上調(diào)。本研究擬檢測浙江地區(qū)漢族CD患者腸組織中的Th1、Th2、Th17細胞相關轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、GATA-3、RORγt)和細胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-17A)表達水平，并分析其比例失衡與CD的關系，以期為深入揭示CD的免疫學發(fā)病機制提供依據(jù)。

材料與方法

一、研究對象

收集2013年1月—2014年12月溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科收治的CD患者36例，其中男性16例，女性20例，平均年齡(31.22±5.88)歲，CD診斷參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)》[8]中的診斷標準，經(jīng)臨床、實驗室、影像學、內(nèi)鏡、組織病理學檢查綜合確立。疾病活動性的評估采用簡化CD活動指數(shù)(CDAI)[8]，入組患者緩解期(≤4分)10例，活動期(≥5分)26例。同期選取于該院行腸息肉摘除術的患者40例作為對照組，其中男性19例，女性21例，平均年齡(30.61±6.13)歲，經(jīng)相關檢查排除感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病。兩組受試者均為相互間無血緣關系的浙江地區(qū)漢族居民，性別構成和平均年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，受試者均簽署知情同意書。

二、方法

1. 標本采集：CD患者取病變部位腸組織，對照組腸息肉患者取相同部位正常腸組織，一部分以 0.9%NaCl溶液反復沖洗后液氮快速冷卻，-80 ℃冰箱保存，用于real-time PCR；另一部分4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，制作病理切片。

2. Real-time PCR檢測Th1、Th2、Th17細胞相關轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子表達：以TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific)提取腸組織總RNA，檢測RNA純度和濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行real-time PCR，引物由武漢谷歌生物科技有限公司設計、合成(表1)。25 μL反應體系中含cDNA 2.5 μL、上下游引物各1.0 μL、2×SYBR Green qPCR Mix(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)12.5 μL和適 量去離子水。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)40次。2-△△CT法計算目的基因mRNA相對表達量。

表1 Th1、Th2、Th17細胞相關轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子PCR引物序列

目的基因引物序列β-actinF5’-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3’ (內(nèi)參)R5’-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3’T-betF5’-TGTGACCCAGATGATTGTGC-3’R5’-TGGAAAGTAAAGATATGCGTGTT-3’GATA-3F5’-CGAGATGGCACGGGACACTA-3’R5’-TGGTCTGGATGCCTTCCTTCTT-3’RORγtF5’-GAAGTGGTGCTGGTTAGGATGT-3’R5’-TTGCAGAGATGATGATGAAAGG-3’IFN-γF5’-CAGCTCTGCATCGTTTTGGG-3’R5’-GTTCCATTATCCGCTACATCTGAA-3’IL-4F5’-CCACAGGCACAAGCAGCTG-3’R5’-CAGGCCCCAGAGGTTCCT-3’IL-17AF5’-ATGGGGAAAATGAAACCCTC-3’R5’-TCAGCTCCTTTCTGGGTTGT-3’

3. 免疫組化法檢測Th1、Th2、Th17細胞相關細胞因子表達：腸組織石蠟包埋，5 μm厚切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，枸櫞酸抗原修復液95 ℃ 40 min，3% H2O225 min，5%山羊血清封閉，滴加鼠抗人IFN-γ、IL-4、IL-17A抗體(1∶20稀釋，Santa Cruz Biotechnology)，4 ℃過夜，以PBS代替一抗作為陰性對照，PBS沖洗切片3次，滴加HRP標記山羊抗鼠二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)，37 ℃ 50 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精復染，二甲苯脫水，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)棕黃色免疫陽性物質(zhì)為陽性細胞。每張切片隨機選取5個視野(×200)，Image-Pro Plus 6.0軟件進行半定量分析。目的蛋白相對表達量以陽性區(qū)域積分光密度值(IOD)與陽性面積(μm2)的比值表示。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、Th1、Th2、Th17細胞相關轉(zhuǎn)錄因子表達

Real-time PCR檢測顯示，CD組腸組織中T-bet、RORγt mRNA相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，兩組間GATA-3 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計 學意義(P>0.05)；活動期CD T-bet、RORγt mRNA相對表達量顯著高于緩解期(P<0.05)，兩亞組間GATA-3 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。上述結果表明CD患者尤其是活動期CD患者腸組織中有大量Th1、Th17細胞浸潤。

二、Th1、Th2、Th17細胞相關細胞因子表達

Real-time PCR檢測顯示，CD組腸組織中IFN-γ、IL-17A mRNA相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)，兩組間IL-4 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；活動期CD IFN-γ、IL-17A mRNA相對表達量顯著高于緩解期(P<0.05)，兩亞組間IL-4 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

免疫組化法檢測顯示，IFN-γ、IL-4、IL-17A免疫陽性物質(zhì)均定位于細胞質(zhì)，蛋白表達在CD組和對照組中的趨勢與mRNA表達一致。在CD患者的腸組織中，IFN-γ+、IL-17A+細胞主要分布于上皮層和黏膜固有層，表達強度顯著高于對照組(P<0.05)，其中活動期CD又顯著高于緩解期(P<0.05)；IL-4在CD組和對照組腸組織中均為少量棕黃色表達，CD組與對照組間、活動期與緩解期CD間表達強度差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述結果進一步證實CD患者腸組織中有大量Th1、Th17細胞浸潤，相關細胞因子表達水平顯著上調(diào)，以活動期CD為著(表2、圖1)。

三、Th1、Th2、Th17細胞失衡與CD的關系

Spearman秩相關系數(shù)分析顯示，CD患者腸組織中的T-bet、GATA-3、RORγt mRNA表達分別與INF-γ、IL-4、IL-17A mRNA表達呈顯著正相關(r=0.551,P=0.012;r=0.621,P=0.027;r=0.542,P=0.002)。分別以T-bet/GATA-3、RORγt/GATA-3和RORγt/T-bet比值表示Th1/Th2、Th17/Th2和Th17/Th1比例，結果顯示T-bet/GATA-3、RORγt/GATA-3比值顯著高于對照組(P<0.05)，兩組間RORγt/T-bet比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示Th1、Th17細胞極化與CD密切相關；與緩解期CD相比，活動期CD不僅T-bet/GATA-3、RORγt/GATA-3比值顯著增高(P<0.05)，RORγt/T-bet比值亦顯著增高(P<0.05)，表明活動期CD腸組織中Th1、Th17細胞增多且以Th17細胞為著(表3)。

表1 腸組織Th1、Th2、Th17細胞相關轉(zhuǎn)錄因子表達

表2 腸組織Th1、Th2、Th17細胞相關細胞因子表達

圖1 對照組和CD組腸組織IFN-γ、IL-4、IL-17A免疫組化染色(×200)

討 論

免疫功能紊亂是IBD發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)Th1、Th2和Th17細胞比例失衡與腸道免疫失調(diào)有密切關聯(lián)[9]，效應CD4+T細胞異常活化是導致腸黏膜免疫反應異常及其后續(xù)炎癥反應的重要機制之一， 幼稚T細胞向不同方向極化后產(chǎn)生的相應細胞因子反應是決定IBD發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的重要病理生理因素。Th1和Th2細胞是CD4+T細胞中較早 被發(fā)現(xiàn)的亞群。通常認為抗原呈遞細胞分泌IFN-γ后作用于幼稚T細胞上的轉(zhuǎn)錄因子STAT1，后者轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)激活Th1細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet，促進幼稚T細胞向Th1細胞分化。Th1細胞主要分泌INF-γ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-2等促炎細胞因子，增強免疫細胞殺傷細胞內(nèi)病原體的能力。在IL-4的作用下，幼稚T細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3激活，通過下游靶基因表達使幼稚T細胞向Th2細胞分化，后者主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子。Th2細胞可誘導機體產(chǎn)生特異性抗體以清除細胞外病原體，并協(xié)助激活B細胞調(diào)節(jié)體液免疫。Th17細胞是一類具有與Th1、Th2細胞亞群不同分化機制和功能特征的新型CD4+T細胞亞群，RORγt和RORα是調(diào)控其分化進程的關鍵轉(zhuǎn)錄因子(RORα主要起協(xié)同RORγt的作用)，主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等，在誘導TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子、CXC趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達，以及中性粒細胞的增殖、成熟、趨化等過程中發(fā)揮重要作用[3,10]。盡管Th1、Th2、Th17細胞因轉(zhuǎn)錄因子和功能特征不同而被歸為不同CD4+T細胞亞群，但三者在分化和功能上相互制約、相互影響，共同維持機體免疫穩(wěn)態(tài)。

表3 腸組織Th1/Th2、Th17/Th2、Th17/Th1細胞比例

本研究real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測結果顯示，CD患者腸組織中Th1、Th17細胞相關轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、RORγt)和細胞因子(IFN-γ、IL-17A)表達均較對照組顯著上調(diào)，分別代表Th1/Th2、Th17/Th2比例的T-bet/GATA-3、RORγt/GATA-3比值亦較對照組顯著增高，提示Th1、Th17細胞極化與CD密切相關，與既往國內(nèi)外研究報道的Th1、Th17細胞在CD發(fā)病中起重要作用的觀點相符[11-13]。理論上，腸組織中Th1、Th17細胞數(shù)量異常增多將促進IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-17F等促炎細胞因子分泌，激活NF-κB等炎癥信號通路，誘導或加重腸道炎癥反應。值得注意的是，本研究并未發(fā)現(xiàn)代表Th17/Th1細胞比例的RORγt/T-bet比值在CD患者與對照者之間存在顯著差異，而Li等[14]的研究卻發(fā)現(xiàn)CD患者腸黏膜固有層CD4+T細胞中Th17細胞比例顯著增高，Th1細胞比例顯著降低，與本研究結果不符，可能與研究對象臨床病理特征不同以及T細胞亞群檢測方法的差異有關。

本研究進一步分析了活動期與緩解期CD間Th1、Th2、Th17細胞比例的差異，結果顯示活動期CD腸組織中Th1、Th17細胞相關轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子表達和Th1/Th2、Th17/Th2比例均較緩解期進一步增高。令人感興趣的是，與緩解期CD相比，活動期CD代表Th17/Th1比例的RORγt/T-bet比值亦顯著增高，表明疾病活動期時Th17細胞極化較Th1細胞更為明顯。既往國內(nèi)外較多研究[1-2,11-13,15]發(fā)現(xiàn)CD患者外周血或腸組織中的Th1、Th17細胞比例或數(shù)量與疾病活動性呈正相關。然而亦有研究結果持不同觀點。加拿大一項研究[14]表明，CD患者腸黏膜固有層Th1細胞比例與內(nèi)鏡疾病活動性評分Rutgeerts評分無相關性，以英夫利昔單抗誘導CD臨床緩解后，Th1細胞比例未見明顯改變。丹麥學者Dige等[5]報道，活動期CD患者以阿達木單抗誘導臨床緩解后，外周血中IL-17A+IL-21+Th17細胞比例較活動期增加2～3倍。Raza等[16]的研究結果則顯示CD患者外周血單核細胞分泌的IL-17A水平與疾病活動性無關。一項隨機雙盲安慰劑對照臨床試驗甚至發(fā)現(xiàn)，人IL-17A單克隆抗體蘇金單抗(secukinumab)用于中重度活動期CD患者的誘導緩解治療不僅無效，甚至可升高炎癥指標血清C-反應蛋白和糞乳鐵蛋白水平[4]。因此，Th1、Th17細胞極化與CD疾病活動性的關系仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究結果表明腸組織中Th1、Th2、Th17細胞失衡與浙江地區(qū)漢族人群CD發(fā)病和病情進展密切相關，Th1、Th17細胞極化可能在其中起重要作用，活動期CD 以Th17細胞極化為著。本研究采用腸息肉患者的正常腸組織作為對照，盡管目前尚無證據(jù)認為腸息肉的發(fā)生、發(fā)展與CD4+T細胞亞群失衡有關，但此對照設置仍可能存在潛在偏倚。后續(xù)擬納入行結腸鏡檢查的健康體檢者作為對照以進一步明確CD4+T細胞亞群失衡與CD發(fā)病的確切關系。

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(2016-12-11收稿；2017-01-16修回)

Imbalance among Th1, Th2 and Th17 Cells and Crohn’s Disease

XIAShenglong1,XUEZhanxiong1,CAIZhenzhai1,XIAXuanping1,TANGYibing2,JIANGYi1.

1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofPathology,theSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou,ZhejiangProvince(325000)

Correspondence to: JIANG Yi, Email: wzjiangyi@yeah.net

Background: Dysregulated immune response is crucial for the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Recent studies suggested that imbalance among Th1, Th2 and Th17 cells was closely related to the aberrant intestinal immune response. Aims: To investigate the association of imbalance among Th1, Th2 and Th17 cells and Crohn’s disease (CD). Methods: Thirty-six CD patients admitted from Jan. 2013 to Dec. 2014 at the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University were enrolled; 40 patients undergoing intestinal polypectomy were collected as controls. Inflamed and normal mucosal tissues were obtained from CD patients and the controls, respectively; expressions of Th1, Th2 and Th17 cells related transcriptional factors (T-bet, GATA-3 and RORγt) and cytokines (IFN-γ, IL-4 and IL-17A) were determined by real-time PCR and immunohistochemistry. Results: In comparison with the controls, mRNA expression of T-bet and RORγt, mRNA and protein expressions of IFN-γ and IL-17A, as well as the ratios for T-bet/GATA-3 and RORγt/GATA-3, which represented balance of Th1/Th2 and Th17/Th2, respectively, were all significantly increased in inflamed mucosal tissue in CD patients (P<0.05). Expression of each of the three transcriptional factors was positively correlated with its corresponding cytokine (P<0.05). IFN-γ+and IL-17A+cells mainly located in the intestinal epithelial layer and lamina propria with cytoplasmic immunoreactivities in CD patients. In the stratified analysis, all the above-mentioned parameters were significantly higher in active CD than in inactive CD (P<0.05); furthermore, the ratio for RORγt/T-bet, which represented balance of Th17/Th1, was also increased significantly in active CD (P<0.05). Conclusions: Imbalance among Th1, Th2 and Th17 cells in intestinal mucosal tissue was closely related with CD. Polarization of Th1 and Th17 cells are involved in this process, and Th17 polarization is predominant in active disease.

Crohn Disease; Th1 Cells; Th2 Cells; Th17 Cells

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.06.003

浙江省自然科學基金(LY14H030012，LY15H030018，LY16H160055，LY17H030011)；浙江省衛(wèi)生科技計劃資助項目(2012KYA132)；溫州市科技局資助項目(Y20160102)

#Email: 526315332@qq.com

&本文通信作者，Email: wzjiangyi@yeah.net