SPE-GC-MS/MS法測(cè)定茶葉中49種農(nóng)藥殘留

王吉祥，牛之瑞，馮雷，白祥，杜四淮，譚建林，張曉紅

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南昆明650223）

SPE-GC-MS/MS法測(cè)定茶葉中49種農(nóng)藥殘留

王吉祥，牛之瑞，馮雷，白祥，杜四淮，譚建林，張曉紅

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南昆明650223）

建立固相萃取-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中49種農(nóng)藥殘留的分析方法。樣品經(jīng)乙腈均質(zhì)提取，經(jīng)ENVI-Carb+Florisil固相萃取小柱進(jìn)行凈化后，采用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下測(cè)定，外標(biāo)法定量。49種農(nóng)藥成分在10μg/L～100μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.995 2～0.999 9范圍內(nèi)；49種農(nóng)藥成分在3個(gè)添加水平下（10、50、100 μg/L），加標(biāo)回收率范圍為71.43%～115.21%，RSD（n=6）為1.13%～11.05%；各農(nóng)藥成分的檢出限均小于1.06 μg/kg。該方法樣品處理簡(jiǎn)單快速，靈敏度和選擇性高，適用于日常檢測(cè)工作。

茶葉；氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法；農(nóng)藥殘留

云南是我國(guó)古老的茶區(qū)，茶產(chǎn)業(yè)是云南省的民生產(chǎn)業(yè)，同時(shí)茶葉是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物，也是我國(guó)主要出口農(nóng)產(chǎn)品之一。近年來(lái)，歐盟以及日本等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)進(jìn)口茶葉的農(nóng)藥殘留檢測(cè)項(xiàng)目不斷增加，對(duì)限量標(biāo)準(zhǔn)的要求也日趨嚴(yán)格[1-3]。茶葉的安全衛(wèi)生狀況，特別是農(nóng)藥殘留問(wèn)題，始終是全世界關(guān)注的大問(wèn)題，其分析技術(shù)的提高同樣受到了高度重視。

近年來(lái)，對(duì)茶葉中農(nóng)藥殘留的分析方法有不少報(bào)道，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以其準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)逐步成為茶葉中農(nóng)藥殘留檢測(cè)最常用的方法。在近兩年發(fā)布的茶葉中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，也主要采用了氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。目前國(guó)標(biāo)中尚無(wú)用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)茶葉中多種農(nóng)藥殘留的分析方法[4-6]。

茶葉中含有數(shù)百種化學(xué)成分，基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，常用的色譜方法易受基質(zhì)干擾，且易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[7]。氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)在于其具有極高的選擇性、極強(qiáng)的抗干擾能力、高靈敏度和高通量離子傳輸效率及準(zhǔn)確定量的特點(diǎn)，這使得該技術(shù)在復(fù)雜基質(zhì)背景下仍能完成目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確鑒定。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式的串聯(lián)質(zhì)譜儀（tandem mass spectrometry，MS/MS）正在迅速成為復(fù)雜基質(zhì)樣品中多殘留目標(biāo)化合物篩查分析的理想技術(shù)，在食品安全分析中具有非常廣泛的應(yīng)用。本文建立了固相萃?。瓪庀嗌V－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中49種農(nóng)藥殘留。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、實(shí)用，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)滿足檢測(cè)要求，能夠很好的應(yīng)用于茶葉農(nóng)藥殘留的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

GCMS-TQ8030氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：日本Shimadzu公司；GL-12B高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；N-EVAP氮吹儀：美國(guó)Organomation公司；CPA225D電子天平：德國(guó)Sartorius公司；十二孔固相萃取裝置：美國(guó)Waters公司。

ENVI-Carb固相萃取小柱（3 mL）、Florisil固相萃取小柱（6 mL）：美國(guó)Supelco公司；丙酮、乙腈、正己烷（均為色譜純）：美國(guó)Fisher Scientific公司。

普洱茶、綠茶、紅茶、烏龍茶、白茶由云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提供。

49種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL上述標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷定容至10 mL，配成10.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)實(shí)際需要，梯度稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取制好的茶葉粉末5.0 g，加入20.0 mL乙腈，超聲30 min，5 000 r/min離心10 min，吸取2 mL上清液，低溫氮吹至凈干，用2.0 mL正己烷∶丙酮（2∶1，體積比）溶解，待凈化。

將ENVI-Carb小柱用2.0 mL正己烷∶丙酮（2∶1，體積比）預(yù)淋洗，條件化，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入上述待凈化溶液，用10 mL比色管接收洗脫液約8 mL，低溫氮吹至約1 mL，用正己烷∶丙酮（9∶1，體積比）2 mL溶解，待下一步凈化。

然后將Florisil小柱用2.0 mL正己烷∶丙酮（9∶1，體積比）預(yù)淋洗，條件化，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入上述待凈化溶液，用10 mL比色管接收洗脫液約8 mL，低溫氮吹至凈干，用正己烷定容至0.5 mL，待測(cè)[8-9]。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Rtx-5MS（0.25 mm×0.25 μm×30 m）石英毛細(xì)管柱；載氣：氦氣，純度≥99.999%；進(jìn)樣口溫度：250℃；柱溫：初始溫度50℃，保持1 min，然后以25℃/min程序升溫到125℃，再以10℃/min程序升溫到300 ℃，保持 15 min；柱流速：1.69 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，1 min后開閥。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊電離源（EI源）電壓為70 eV；離子源溫度200℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時(shí)間1.5 min；碰撞氣：氬氣（純度≥99.999%）；島津GC Solution工作站。49種農(nóng)藥成分的保留時(shí)間及優(yōu)化的MRM參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇[10-15]

茶葉中含有大量色素，特別是普洱茶、紅茶中色素含量更高，且同時(shí)檢測(cè)的農(nóng)藥品種數(shù)量較多，極性差異較大，因而對(duì)樣品提取溶劑的選擇要求較高。本文采用乙酸乙酯、乙腈、丙酮、二氯甲烷作為提取溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二氯甲烷溶出的色素和油脂較少，但不能充分提取所有農(nóng)藥；丙酮和乙酸乙酯能充分提取出大多數(shù)農(nóng)藥，同時(shí)也溶出大量的油脂和色素，增加了凈化步驟和難度；乙睛作為極性較強(qiáng)的溶劑對(duì)大多數(shù)農(nóng)藥都能有效提取，且油脂和色素溶出率低，基質(zhì)干擾小，回收率理想，乙腈與凈化時(shí)的SPE柱相匹配，無(wú)需濃縮可直接過(guò)柱，操作簡(jiǎn)便。因此本試驗(yàn)采用乙睛作為提取溶劑。

2.2 固相萃取柱的選擇

參照現(xiàn)行農(nóng)藥殘留測(cè)定有關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法及國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[10-15]，本文比較了常用于農(nóng)藥殘留的幾種固相萃取柱：ENVI-carb+NH2柱、ENVI-carb+PSA柱和ENVI-carb+Florisil柱，結(jié)果ENVI-Carb+Florisil柱的凈化效果最好，供試品溶液顏色最淺，總離子流中干擾峰較少，回收率最好，基質(zhì)效應(yīng)也較低，最終選用ENVI-Carb/Florisil固相萃取柱作為固相萃取凈化方法。本方法采用ENVI-carb固相萃取柱作為固相萃取凈化方法。見圖1。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本方法選擇MRM下的2對(duì)離子對(duì)進(jìn)行各農(nóng)藥的分析，其中1對(duì)離子對(duì)用于定量分析。為了獲得最佳的質(zhì)譜條件以保證對(duì)分析物定量和定性的準(zhǔn)確性，對(duì)待測(cè)物的前級(jí)離子、產(chǎn)物離子、碰撞能量等一系列質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。首先采用全掃描（Full Scan）方式獲取待測(cè)物的前級(jí)離子，之后采用產(chǎn)物離子掃描方式（Product Scan）通過(guò)優(yōu)化碰撞能量獲得產(chǎn)物離子，最后采用MRM模式對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性和定量分析。經(jīng)過(guò)方法優(yōu)化可以得到較為理想的質(zhì)譜條件和分離效果。每種農(nóng)藥的離子對(duì)和碰撞能，優(yōu)化后見表1。圖2為優(yōu)化條件下10 μg/mL基質(zhì)加標(biāo)工作液的總離子流（TIC）色譜圖。

圖1 49種農(nóng)藥三種凈化方法的回收率Fig.1 Recoveries of 49 pesticide residues obtained by three Purification methods

圖2 49種農(nóng)藥的總離子流色譜圖Fig.2 Chromatogram of MRM for 49 pesticide residues

表1 49種農(nóng)藥成分的保留時(shí)間及優(yōu)化的MRM參數(shù)Table 1 Retention time and optimized MRM conditions of 49 pesticides

續(xù)表1 49種農(nóng)藥成分的保留時(shí)間及優(yōu)化的MRM參數(shù)Continue table 1 Retention time and optimized MRM conditions of 49 pesticides

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

茶葉成分復(fù)雜，對(duì)于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)也有一定的影響，有些可能有基質(zhì)增強(qiáng)作用，有些可能有基質(zhì)減弱效應(yīng)。對(duì)于氣質(zhì)農(nóng)藥殘留分析，通常會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，具體表現(xiàn)為使用農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品定量時(shí)會(huì)出現(xiàn)某種農(nóng)藥的回收率低于或高于可接受范圍。為了避免藥材本身帶來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)，采取基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的方法消除和減弱基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)利用選擇離子定量檢測(cè)也可以大大提高分析方法的選擇性，排除一些雜質(zhì)的干擾，最終獲得較滿意的試驗(yàn)結(jié)果。

2.5 線性關(guān)系與檢出限

在質(zhì)量濃度為10 μg/L～100 μg/L范圍內(nèi)，用基質(zhì)配制成5個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，在所確定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，分別對(duì)49種農(nóng)藥成分的峰面積對(duì)其濃度進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以S/N≥3確定每種農(nóng)藥成分的檢出限。結(jié)果表明：所測(cè)定的49種混合農(nóng)藥的質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99，各農(nóng)藥成分的檢出限均小于1.06 μg/kg，具體結(jié)果見表2。

表2 49種農(nóng)藥的線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限以及加標(biāo)回收率和精密度Table 2 Linear equations，correlation coefficients（R2），limits of detection，the average recoveries and the relative standard deviations（RSD）for 49 pesticides

2.6 添加回收率和精密度

將農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液添加到茶葉提取物中，分別制成質(zhì)量濃度為 10、50、100 μg/kg的加標(biāo)樣品溶液，在同一分析條件下進(jìn)行6次試驗(yàn)，計(jì)算各濃度下平均回收率及RSD。結(jié)果表明：49種農(nóng)藥成分在3個(gè)添加水平下（10、50、100 μg/L），加標(biāo)回收率范圍為71.43%～115.21% ，RSD（n=6）為 1.13%～11.05%，方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差滿足多農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的準(zhǔn)確度和精密度的要求，測(cè)定結(jié)果見表2。

2.7 方法適用性

采用本方法對(duì)100個(gè)茶葉樣品（普洱茶30個(gè)、紅茶20個(gè)、綠茶20個(gè)、烏龍茶15個(gè)、白茶15個(gè)）進(jìn)行了分析測(cè)定，僅有聯(lián)苯菊酯1種農(nóng)藥檢出，含量在0.010 mg/kg～0.078 mg/kg之間（均為普洱茶），GB2763-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定茶葉中聯(lián)苯菊酯的最大殘留限量分別為5 mg/kg，檢出的農(nóng)藥殘留水平均顯著低于國(guó)家最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)條件，利用氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜儀，建立了對(duì)茶葉中49種農(nóng)藥同時(shí)進(jìn)行分析的方法。本方法條件下49種農(nóng)藥完全基線分離，每種化合物選擇特征離子的兩個(gè)二級(jí)離子，降低干擾，提高了靈敏度，特別對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)中假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行排除。49種農(nóng)藥成分在10 μg/L～100 μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.995 2～0.999 9范圍內(nèi)；49種農(nóng)藥成分在 3 個(gè)添加水平下（10、50、100 μg/L），加標(biāo)回收率范圍為 71.43%～115.21%，RSD（n=6）為1.13%～11.05%；各農(nóng)藥成分的檢出限均小于1.06 μg/kg。本分析方法獲得了滿意的分離效果和檢測(cè)靈敏度，回收率、精密度，滿足農(nóng)藥多殘留分析的要求，檢出限能滿足歐盟及美國(guó)、日本等國(guó)的限量要求，該方法為茶葉中多農(nóng)殘測(cè)定提供了簡(jiǎn)便的前處理方法和檢測(cè)手段。

[1] 岳永德,花日茂,張承祥.茶葉農(nóng)藥殘留與控制[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001:24-25

[2] 佚名.日本《食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度》對(duì)我國(guó)茶葉出口的影響及應(yīng)對(duì)措施[J].農(nóng)化市場(chǎng)十日訊,2006(17):11

[3] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:75

[4] 施家威,李繼革,王玉飛,等.固相萃取-氣相色譜/三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜分析蔬菜中42種農(nóng)藥殘留[J].色譜,2010,28(12):1137-1143

[5] 沈偉健,余可垚,桂茜雯,等.分散固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中107種農(nóng)藥的殘留量[J].色譜,2009,27(4):391-400

[6] 孫磊麗,李曉玉,隋濤.氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定菠菜中有機(jī)氯殘留量[J].廣州化工,2010,38(11):155-157

[7] 易盛國(guó),侯雪,韓梅,等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蔬菜農(nóng)藥殘留基質(zhì)效應(yīng)與基質(zhì)分類的研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,25(2):537-543

[8]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.NY/T 761-2008蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法[S].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2008

[9]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 19648-2006水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006

[10]王連珠,周昱,陳泳,等.QuEChERS樣品前處理-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中66種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量方法評(píng)估[J].色譜,2012,30(2):146

[11]宋淑玲,李重九,馬曉東,等.蔬菜中殘留農(nóng)藥的石墨化碳黑凈化和氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法[J].分析化學(xué),2008,36(11):23

[12]LEHOTAY SJ,DE KOK A,HIEMSTRA M,et al.Validation of a fast and easy method for the determination of residues from 229 pesticides in fruits and vegetables using gas and liquid chromatography and mass spectrometric detection[J].JAOAC Int,2005,88(2):595

[13]ANASTASSIADES M,LEHOTAY SJ,STAJNBAHER D,et al.Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and dispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues in produce[J].JAOAC Int,2003,86(2):412

[14]LEHOTAY S J,SON K A,KWON H.Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables[J].Journal of Chromatography A,2010,1217(16):2548-2560

[15]WILKOWSKA A,BIZIUK M.Determination of pesticide residues in food matrices using the QuEChERS Methodology[J].Food Chemistry,2011,125(3):803-812

Determination of 49 Kinds of Pesticide Residues in Tea by SPE and Gas Chromatography－Tandem Mass Spectrometry

WANG Ji-xiang，NIU Zhi-rui，F(xiàn)ENG Lei，BAI Xiang，DU Si-huai，TAN Jian-lin，ZHANG Xiao-hong（Yunnan Product Quality Supervision and Testing Academy，Kunming 650223，Yunnan，China）

To develop an analysis method based on solid-phase extraction and gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry（SPE-GC-MS/MS）or the determination of 49 kinds of pesticide residues in Tea.Samples were extracted with acetonitrile，and then purified through ENVI-Carb+Florisil solid phase extraction（SPE）cartridge，the prepared samples were then analyzed by GC-MS/MS in MRM mode，and the external standard method was applied to quantify the pesticides.All the 49 pesticides showed good linearity in the range of 10 μg/L to 100 μg/L （R2=0.995 2-0.999 9），the average recoveries of all the pesticides were in the range of 71.43%to 115.21%at three spiked levels of 10，50，100 μg/L，the RSD （n=6）were in the range of 1.13%to11.05%；and the limits of detection（LOD）were all below 1.06 μg/kg.The method is suitable for the multiresidues analysis of pesticides in Tea.

tea；gaschromatography-tandem massspectrometry（GC-MS/MS）；pesticide residues

2016-10-09

王吉祥（1983—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：農(nóng)藥殘留檢測(cè)。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.037