運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中磺胺類成分的殘留檢測

陶彌鋒

（江西科技學(xué)院體育部，江西南昌330029）

運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中磺胺類成分的殘留檢測

陶彌鋒

（江西科技學(xué)院體育部，江西南昌330029）

建立一種用高效液相色譜法測定運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中9種磺胺類成分殘留的檢測方法。樣品經(jīng)乙醇提取后，過固相萃取柱后上機(jī)檢測。采用ZORBAX SB C18分析色譜柱分離，以甲醇-1.0%甲酸作為流動(dòng)相的梯度洗脫模式下，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明，9種組分在0.05 μg/mL～10.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 0～0.999 8，檢出限在 10 μg/kg～15 μg/kg，定量限在 30 μg/kg～45 μg/kg，加標(biāo)回收率達(dá)到 79.2%～84.7%。

高效液相色譜；運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品；磺胺類藥物

運(yùn)動(dòng)員和從事健身運(yùn)動(dòng)的人對(duì)多種營養(yǎng)素如碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、無機(jī)鹽、水等的需要都要高于不從事運(yùn)動(dòng)的人。在膳食營養(yǎng)不能滿足機(jī)體的需求時(shí)，這些營養(yǎng)素補(bǔ)充劑就成了不可缺少的營養(yǎng)品。其中蛋白質(zhì)的補(bǔ)充在運(yùn)動(dòng)隊(duì)以及健身人群，乃至于一般人群中越來越流行。而蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑多數(shù)是由牛奶以及動(dòng)物組織制成，然而隨著磺胺類藥物在動(dòng)物飼養(yǎng)上的濫用，建立以含動(dòng)物性蛋白為基質(zhì)的運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中磺胺類殘留的檢測方法十分必要，特別是對(duì)運(yùn)動(dòng)員這類特殊人群來說，評(píng)價(jià)此類食品的安全具有重要意義。

磺胺類物質(zhì)是對(duì)氨基苯磺酸的衍生物，其分子中含有苯環(huán)、對(duì)氨基（N4）和磺酰胺基，如圖1所示，各種化學(xué)基團(tuán)取代R基而形成大量有效的衍生物?；前奉愃幬锸秋曫B(yǎng)動(dòng)物時(shí)廣泛使用的一類廣譜抗菌性藥物，能引起過敏反應(yīng)、排尿和造血紊亂等副作用。歐盟將磺胺類藥物列為必須嚴(yán)格限制使用的藥物，并規(guī)定動(dòng)物源食品中磺胺類藥物的最大殘留限量為0.1 μg/g，我國頒布的《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》（農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告）中明確規(guī)定所有動(dòng)物性食品中磺胺類藥物的殘留不得超過100 μg/kg[1-3]。

圖1 磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of sulfanilamide

目前檢測磺胺類藥物的方法主要有氣相色譜法（GC）[4-5]、高效液相色譜法[6-8]、液-質(zhì)聯(lián)用法（LC/MS）[9-10]等。GC法需要煩瑣的衍生化步驟，樣品前處理復(fù)雜，不適合批量樣品的分析，其應(yīng)用受到了限制。LC/MS法是近年來發(fā)展起來的一種新的方法，具有定性準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)，但由于儀器昂貴而不能在普通實(shí)驗(yàn)室推廣。HPLC法是目前在普通實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的檢測方法，比較適合普及。本研究建立了一種可同時(shí)檢測運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中9種磺胺類藥物的高效液相色譜法，對(duì)凈化和色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化，考察了方法的檢出限、回收率和線性范圍等，獲得了良好的分析結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2695型高效液相色譜系統(tǒng)、2998型配二極管檢測器：美國Waters公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品（磺胺嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺硝苯、磺胺吡啶、磺胺喹惡琳、磺胺二甲氧噠嗪、磺胺噻唑、磺胺多辛）：Sigma公司；乙腈、甲醇均為色譜純：美國Fisher Scientific公司。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機(jī)購買市場上銷售的運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品。

1.3 色譜條件

流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：246 nm。

1.4 方法

1.4.1 色譜柱的選擇

本試驗(yàn)比較了常用的3種色譜柱對(duì)9種磺胺類藥物的分離度和檢測靈敏度的影響。

1.4.2 流動(dòng)相體系對(duì)磺胺類藥物色譜行為的影響

依據(jù)磺胺類藥物結(jié)構(gòu)中都含有氨基，具有弱堿性，流動(dòng)相中的酸度對(duì)磺胺類藥物在色譜柱上的分離會(huì)有很大的影響。本試驗(yàn)考察不同pH值的流動(dòng)相體系以及洗脫模式對(duì)磺胺類藥物在色譜柱上分離效果的影響。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的9種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為 0.05、0.10、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行儀器分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中除了固有的一些食品基質(zhì)外，還含有很多人為添加的營養(yǎng)元素，成分復(fù)雜，對(duì)前處理要求高，所以本試驗(yàn)樣品前處理對(duì)4種不同的提取溶劑進(jìn)行比較后，選用固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化，并對(duì)常用的固相萃取柱對(duì)比凈化效果，選用合適的固相萃取小柱，結(jié)果以樣品加標(biāo)平均回收率為比較依據(jù)，制定較優(yōu)的前處理?xiàng)l件。

1.4.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

以市場上隨機(jī)購買的運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品為基質(zhì)，加入9種磺胺類藥物的混標(biāo)溶液，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件操作，上機(jī)檢測，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

根據(jù)磺胺類藥物的性質(zhì)，本試驗(yàn)就常用的ZORBAX SB C18、Eclipse Plus C18和 Extend C18等 3 種色譜柱對(duì)9種磺胺類藥物的分離度和檢測靈敏度進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果表明，ZORBAX SB C18色譜柱更適合分析9種磺胺類藥物，雖然色譜柱Eclipse Plus C18分析時(shí)用時(shí)更短，但不能將每種磺胺類藥物很好的分離以及有良好的峰形，在粒徑相同的情況下，采用ZORBAX SB C18色譜柱，能在合理的時(shí)間（30 min）內(nèi)獲得良好的分離度。

2.2 流動(dòng)相體系對(duì)磺胺類藥物色譜行為的影響

參考相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)，比較了4種pH值流動(dòng)相體系對(duì)目標(biāo)物的分離效果：Ⅰ甲醇-0.1%甲酸、Ⅱ甲醇-0.5%甲酸、Ⅲ甲醇-1.0%甲酸、Ⅳ甲醇-2.0%甲酸。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲酸濃度超過1.0%時(shí)，體系中甲酸濃度的變化對(duì)于磺胺類藥物的分離影響較小，因此本試驗(yàn)中流動(dòng)相體系采用1.0%的甲酸作為水相。

在調(diào)節(jié)有機(jī)相甲醇的相對(duì)含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，甲醇的相對(duì)含量變化對(duì)磺胺類藥物的分離影響較大。當(dāng)甲醇比例太少時(shí)，磺胺類物質(zhì)洗脫太慢，導(dǎo)致的分離時(shí)間過長；當(dāng)甲醇比例過高時(shí)，磺胺類物質(zhì)的掛柱時(shí)間太短，導(dǎo)致目標(biāo)物的分離度不夠。所以為了使磺胺類藥物均達(dá)到有效的分離，本試驗(yàn)經(jīng)過摸索，在甲醇-1.0%甲酸的流動(dòng)相體系下選擇梯度洗脫模式，洗脫條件見表1，9種目標(biāo)物能得到了很好的分離，未發(fā)現(xiàn)干擾峰，峰型尖銳且對(duì)稱，如圖2所示。

表1 甲醇-1.0%甲酸為流動(dòng)相的梯度洗脫條件Table 1 The gradient elution mode by methano-1.0%formic acid as mobile phase

圖2 9種磺胺類藥物色譜圖Fig.2 The chromatogram of nine sulfonamides standards

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗(yàn)證9種磺胺類藥物在甲醇-1.0%甲酸的流動(dòng)相體系中的線性關(guān)系，配制了9種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，濃度分別為 0.05、0.10、1.00、2.00、5.00、10.00μg/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，9種目標(biāo)物在0.05 μg/mL～10.00 μg/mL 內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.99）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到9種目標(biāo)組分的LOD和LOQ分別為 10 μg/kg～15 μg/kg 和 30 μg/kg～45 μg/kg，結(jié)果見表2。

2.4 前處理過程的優(yōu)化

參考相關(guān)文獻(xiàn)，針對(duì)于樣品提取液的選擇，分別選用丙酮、二氯甲烷、乙醇、乙腈等4種溶劑來進(jìn)行比較，分別稱取10.0 g試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入提取液定容至刻度，高速均質(zhì)2 min后過濾。

由于運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中的基質(zhì)比較復(fù)雜，要同時(shí)分析多種磺胺藥物殘留，僅僅靠提取溶劑的分離很難去除樣品中的干擾物和雜質(zhì)，因此本試驗(yàn)比較了常用的幾種固相萃取小柱對(duì)提取液的凈化效果，選擇凈化效果較優(yōu)的固相萃取小柱進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果以樣品加標(biāo)的平均回收率進(jìn)行比較。

表2 9種磺胺類藥物的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 2 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of nine kinds of sulfanilamide

結(jié)果如圖3所示，用丙酮和二氯甲烷作為提取液中，磺胺類藥物的回收率很低；乙腈和乙醇的提取效率高，但是磺胺類藥物的耐熱性差，而乙腈的沸點(diǎn)高，從而對(duì)濃縮帶來很大的困難。而且乙醇作為提取液在經(jīng)固相萃取柱凈化后不存在干擾，所以本試驗(yàn)選擇乙醇作為樣品的提取溶劑。

圖3 提取液對(duì)9種磺胺類藥物平均回收率的影響Fig.3 The effect of extract solution on the average recovery rate for the nine kinds of sulfanilamide

常用來凈化磺胺類藥物的固相萃取柱有C18小柱、HLB小柱、硅膠小柱、堿性氧化鋁小柱、SCX小柱和氨基小柱等，其中以C18小柱和HLB小柱最為常用且為反相色譜保留機(jī)制。從磺胺類藥物結(jié)構(gòu)可知，磺胺類是一類弱堿性的藥物，C18固相萃取小柱和HLB小柱理論上都適合磺胺類藥物的凈化，其中C18固相萃取柱主要填充物帶疏水基團(tuán)，適用于中等極性到非極性化合物的凈化。HLB固相萃取小柱的填充材料是二乙烯苯-N-乙烯基吡咯烷酮聚合物具有親脂親水性，而且柱子不怕抽干，碳鏈不會(huì)塌陷。經(jīng)對(duì)C18小柱和HLB小柱的加標(biāo)回收試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HLB固相萃取小柱凈化效果更好、回收率更高、操作要求比C18固相萃取小柱更低，方法更容易重復(fù)，所以本研究采用HLB小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

2.5 樣品的測定及加標(biāo)回收

在市場上購買的20個(gè)批次的運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中，根據(jù)2.4試驗(yàn)結(jié)果選擇優(yōu)化后儀器條件和處理?xiàng)l件，選擇乙醇作為提取溶劑，然后經(jīng)HLB小柱凈化后上機(jī)檢測。9種磺胺類藥物的回收率和精密度試驗(yàn)見表3。

表3 9種磺胺類藥物的回收率和精密度試驗(yàn)（n=5）Table 3 Precisions and recovery rates of nine kinds of sulfonamides（n=5）

結(jié)果表明：在所檢測的運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中，暫未檢出磺胺類藥物的殘留。在樣品的加標(biāo)回收試驗(yàn)中，9種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率在79.2%～84.7%之間，符合檢測要求。

3 結(jié)論

本文建立了一種高效液相色譜法檢測運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中9種磺胺類藥物殘留的分析方法。結(jié)果表明，在甲醇-1.0%甲酸流動(dòng)相體系梯度洗脫的條件下，9種目標(biāo)物能得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時(shí)間合適。樣品在經(jīng)乙醇提取液的提取后，經(jīng)HLB固相萃取小柱可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的凈化，準(zhǔn)確有效地檢測運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品中的磺胺類藥物的殘留。

[1]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 18932.5-2002蜂蜜中磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲基、嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲基異噁唑、磺胺二甲氧嘧啶殘留量的測定方法液相色譜法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003

[2]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 18932.17-2003蜂蜜中16種磺胺殘留量的測定方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004

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Determination of Sulfanilamide Residue in Sports Nutrition

TAO Mi-feng
（Department of Sports，Jiangxi University of Technology，Nanchang 330029，Jiangxi，China）

A rapid and effective method was established for the determination of nine kinds of sulfanilamide residue in sports nutrition by high performance liquid chromatography method.The samples were extracted by ethanol，and detected after purified by solid phase extraction column.The separation of target compound was performed on a ZORBAX SB C18chromatography column using methanol-1.0%formic acid as mobile phase by the gradient elution mode，and external standard method peak area quantification.The results show that the linear range of nine kinds of sulfanilamide was in the range of 0.05 μg/mL-10.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999 0-0.999 8.The detection limit was 10μg/kg-15μg/kg and the quantitative limit was 30 μg/kg-45 μg/kg.The recovery rate was 79.2%-84.7%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sports nutrition；sulfanilamide residue

2017-01-09

陶彌鋒（1976—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.035