超聲波輔助提取黑果腺肋花楸黃酮及其抗運動疲勞研究

李瑞芳

（鄭州工業(yè)應用技術學院，河南鄭州450000）

超聲波輔助提取黑果腺肋花楸黃酮及其抗運動疲勞研究

李瑞芳

（鄭州工業(yè)應用技術學院，河南鄭州450000）

以黑果腺肋花楸作為原料，采用單因素和響應面試驗優(yōu)化超聲波輔助乙醇提取黑果腺肋花楸黃酮工藝，并通過小鼠試驗研究黑果腺肋花楸黃酮抗運動疲勞功能。結果表明，超聲波輔助提取黃酮最佳參數(shù)為超聲功率70 W、超聲溫度61℃、超聲時間124 min，此時，黑果腺肋花楸黃酮提取率可達95.64%。影響黑果腺肋花楸黃酮提取率的因素由強到弱為超聲溫度>超聲時間>超聲功率。小鼠經(jīng)灌胃黑果腺肋花楸黃酮后，小鼠力竭游泳時間顯著延長且濃度越高效果越明顯，血乳酸含量與未灌胃黃酮組小鼠相比顯著降低，由此可說明，黑果腺肋花楸黃酮對小鼠具有較強的抗運動疲勞功能。

響應面；超聲波；黑果腺肋花楸；黃酮；抗疲勞

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）又被稱為不老莓，營養(yǎng)價值很高，果實含有大量的多酚、黃酮以及花色苷等成分，具有多重功能[1-2]，有研究表明，其內(nèi)部含有的多酚在已知植物果實中含量最高，其內(nèi)部的花青素含量也很高，這些功能成分能夠?qū)C體起到降血壓、抗氧化以及清除機體的自由基等功效[3-4]；目前黑果腺肋花楸產(chǎn)品較少，開發(fā)利用率較低，需要研究其功能成分有利于其產(chǎn)品開發(fā)；超聲波法是現(xiàn)代較新型的技術之一，具有環(huán)保、效率高等優(yōu)點[5-6]，很多活性成分提取均采用超聲波法輔助提取[7-8]，本研究采用超聲波法輔助乙醇提取黑果腺肋花楸黃酮，并采用響應面法優(yōu)化其最佳工藝參數(shù)，同時研究黑果腺肋花楸對小鼠的抗運動疲勞功能，可為黑果腺肋花楸功能性產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸：陜西康躍生物科技有限公司；Al（NO3）3、無水乙醇、NaNO2等均為分析純：淄博市臨淄飛碩化工有限公司；蘆丁標準品：上?？道噬锟萍加邢薰尽?/p>

1.2 儀器與設備

FA1004型電子天平：德州市昊誠實驗儀器有限公司；TGL-16G型變頻高速離心機：北京鑫潤科諾儀器儀表有限公司；AUT-M型超聲波發(fā)生器：深圳市潤正洗凈設備有限公司；721G型可見分光光度計：上海金梟電子有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：南京東邁科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助乙醇提取黑果腺肋花楸黃酮工藝流程

黑果腺肋花楸→洗滌→烘干→粉碎→過篩→超聲波輔助乙醇提取→離心分離→過濾→濾液濃縮→干燥→黃酮→待測

1.3.2 黑果腺肋花楸黃酮提取單因素試驗

1.3.2.1 超聲功率對黃酮提取率的影響

在超聲溫度60℃、超聲時間120 min時，超聲功率分別為 50、60、70、80、90 W 時，以黑果腺肋花楸黃酮提取率為考核指標，分析超聲功率對黃酮提取率的影響。

1.3.2.2 超聲溫度對黃酮提取率的影響

在超聲功率70 W、超聲時間120 min時，超聲溫度分別為 50、55、60、65、70℃時，以黑果腺肋花楸黃酮提取率為考核指標，分析超聲溫度對黃酮提取率的影響。

1.3.2.3 超聲時間對黃酮提取率的影響

在超聲功率70 W、超聲溫度60℃時，超聲時間分別為 80、100、120、140、160 min 時，以黑果腺肋花楸黃酮提取率為考核指標，分析超聲時間對黃酮提取率的影響。

1.3.3 黑果腺肋花楸黃酮提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素結果，以超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C），以黃酮提取率（Y）為指標，設計響應面試驗，確定超聲波輔助提取黃酮最佳工藝參數(shù)。試驗設計因素水平見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.3.4 蘆丁標準曲線的繪制[9-10]

精確稱取蘆丁標品1 g置于燒杯中，加入乙醇（75%）定容至100 mL，靜止20 min后，再從中取5 mL于容量瓶中，再加乙醇定容至100mL，可得到0.5mg/mL蘆丁標準溶液；從中分別取 0、1、2、3、4、5、6 mL 溶液于25 mL具塞比色管里，再加入無水乙醇至10 mL，再加5%的NaNO20.8 mL，混勻后靜置5min，再加10%的Al（NO3）30.8 mL，混勻后靜置5 min，再加NaOH溶液（3%）5 mL，再加乙醇至 25 mL，混勻后靜置 20 min，分別于510 nm波長處測吸光度，同時用去離子水做對照。以蘆丁質(zhì)量濃度為X軸、吸光值為Y軸，得回歸方程：Y=0.421X＋0.002，R2=0.999 8。

1.3.5 黃酮提取率的測定[11-12]

精確稱取5 mL方法1.3.1中制取的濃縮液，同樣加到25 mL具塞比色管中，參照1.3.4中試驗方法，測溶液吸光值，由回歸方程可計算出黃酮含量，再計算黃酮提取率。

1.3.6 小鼠抗疲勞試驗

根據(jù)試驗要求，隨機取80只KM雄性小鼠，重量為（22±0.5）g，SPF級，長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證號為SCXK（湘）2014-0011，根據(jù)體重將小鼠組成4組，每組數(shù)量為20只。規(guī)定第1組小鼠為對照組、第2、3、4組均灌胃黑果腺肋花楸黃酮，劑量分別為0.1 mL/10 g鼠重、0.2 mL/10 g鼠重、0.3 mL/10 g鼠重，持續(xù)灌胃30 d后測小鼠各項指標。

1.3.6.1 小鼠負重游泳實驗[13-14]

小鼠經(jīng)末次灌胃黑果腺肋花楸30 min后，在其尾部負重體重5%的鐵絲，使小鼠在標準小鼠試驗游泳箱中游泳，游泳箱深度35 cm，水溫（25.0±1.0）℃，當小鼠頭部浸入水下10 s后無法浮到水面上即為體力耗竭，記下小鼠自游泳開始至體力耗竭的時間，作為小鼠游泳時間。

1.3.6.2 血乳酸含量測定[15]

小鼠經(jīng)末次灌胃黑果腺肋花楸30 min后，將小鼠置于游泳箱中進行游泳。分別于游泳前、游泳后10 min、游泳10 min休息20 min等3個不同時間段，在小鼠眼眶靜脈叢用標準方法進行采血，參照試劑盒法檢測小鼠全血乳酸含量。

2 結果與分析

2.1 黑果腺肋花楸黃酮提取單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響

超聲功率對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響見圖1。

根據(jù)圖1，當超聲功率為50 W時，黑果腺肋花楸黃酮提取率最低，隨著超聲功率的增大，黃酮提取率逐漸升高，當超聲功率達到70 W時，黑果腺肋花楸黃酮提取率最高。繼續(xù)增大超聲功率后，黑果腺肋花楸黃酮提取率幾乎不變，原因可能為當超聲功率為70 W時已經(jīng)可滿足黃酮的提取，使得黃酮能夠充分溶出，故繼續(xù)增大超聲功率提取率幾乎不變，因此選擇超聲功率60、70、80 W為響應面研究水平。

圖1 超聲功率對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of black fruit Aronia flavonoids

2.1.2 超聲溫度對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響

超聲溫度對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 超聲溫度對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the yield of black fruit Aronia flavonoids

根據(jù)圖2，當超聲溫度為50℃時，黑果腺肋花楸黃酮提取率最低，當超聲溫度升高后，黑果腺肋花楸黃酮提取率迅速增大，當超聲溫度達到60℃時，黑果腺肋花楸黃酮提取率達到最高，繼續(xù)提高超聲溫度后，黑果腺肋花楸黃酮提取率迅速下降，原因可能是溫度過高后使得黃酮損失過多，因此選擇超聲溫度55、60、65℃為響應面研究水平。

2.1.3 超聲時間對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響

超聲時間對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響見圖3。

根據(jù)圖3，當超聲時間為80 min時，黑果腺肋花楸黃酮提取率最低，隨著超聲時間的延長，黑果腺肋花楸黃酮提取率逐漸升高，當超聲時間達到120 min時，黑果腺肋花楸黃酮提取率最高。繼續(xù)延長超聲時間，黑果腺肋花楸黃酮提取率幾乎不變，原因可能是當超聲一定時間后黃酮已經(jīng)完全被提出，因此繼續(xù)延長時間效果不佳，選擇超聲時間為100、120、140 min為響應面研究水平。

圖3 超聲時間對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of black fruit Aronia flavonoids

2.2 黑果腺肋花楸黃酮提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 數(shù)學模型的建立與顯著性檢驗

表2 Box-Benhnken中心組合試驗設計及結果Table 2 Box-Benhnken central composite design arrangement and experimental results

采用Box-Benhnken中心組合試驗設計，根據(jù)單因素結果，進行三因素三水平的RSM（response surface methodology）分析試驗?？疾斐暪β剩ˋ）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）對黑果腺肋花楸黃酮提取率（Y）的影響，試驗設計方案及結果見表2。

采用Design-Expert8.0.6軟件對表2進行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗，得到以黑果腺肋花楸黃酮提取率為目標函數(shù)，關于各條件編碼值的二次回歸方程為：

對該模型進行顯著性檢驗，可得到方差分析見表3，模型的可信度分析見表4。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance table for regression model

表4 回歸模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the regression model

由表3、4可知，模型的P值小于0.000 1，遠小于0.01，說明該模型極顯著，回歸模型與實際測定數(shù)值能夠很好的擬合，試驗誤差較小，因此，可以用該回歸方程代替試驗真實值對試驗結果進行分析，R2=99.19%，預測值與實測值之間具有高度的相關性，說明方程可靠性較高。在回歸模型中，B、C、AB、A2、B2、C2，對響應值影響極顯著，A、AC，對響應值影響顯著。影響產(chǎn)品感官評分由強到弱的因素為超聲溫度>超聲時間>超聲功率。

2.2.2 各因素的交互作用對產(chǎn)品感官評分影響

響應面圖能夠非常直觀的表現(xiàn)出兩個因素之間的相互作用，也是各因素構成的三維曲面圖。通過使一個因素不變，改變另兩個因素，將模型降維分析統(tǒng)計，目的是研究各因素間的相互作用對黑果腺肋花楸黃酮提取率的影響。由軟件分析可得到響應面圖，見圖4。

等高線圖反應兩個因素更直觀，在圖中橢圓形表示兩因素交互作用極顯著或者顯著，而圓形則表示兩因素交互作用不顯著。根據(jù)方差分析可知，超聲功率（A）與超聲溫度（B）之間的交互作用極顯著，具體表現(xiàn)為等高線圖呈明顯的橢圓形；超聲功率（A）與超聲時間（C）之間交互作用顯著，具體表現(xiàn)為等高線圖呈橢圓形。

圖4 各兩因素交互作用響應面及等高線圖Fig.4 Response surfaces and contour plots of the interactive effects of each two factors

2.2.3 優(yōu)化工藝參數(shù)

為進一步確定最佳參數(shù)，對擬合的回歸方程求分別一階偏導數(shù)，并設其為0，得到三元一次方程如下：

求解得：X1＝0.004、X2＝0.278、X3＝0.222，即最佳工藝參數(shù)為超聲功率70.04 W、超聲溫度61.39℃、超聲時間124.43 min，在此條件下黑果腺肋花楸黃酮提取率是94.83%。為便于實際操作，將參數(shù)修正為超聲功率70 W、超聲溫度61℃、超聲時間124 min，采用修正后的工藝參數(shù)進行3次平行驗證試驗，在此條件下黑果腺肋花楸黃酮提取率是95.64%，與理論預測值較為接近，表明數(shù)學模型對優(yōu)化工藝參數(shù)是可行的。

2.3 小鼠負重游泳試驗結果

小鼠負重游泳試驗結果見表5。

表5 小鼠負重游泳試驗結果Table 5 Mice weight loading swimming test results

從結果能夠明顯得出，小鼠經(jīng)灌胃30 d后，游泳時間顯著延長，小鼠經(jīng)灌胃黑果腺肋花楸黃酮濃度越高，小鼠平均游泳時間越長，因此，可說明黑果腺肋花楸黃酮具有抗疲勞功能。

2.4 血乳酸測定結果

小鼠血乳酸測定結果見表6。

表6 黑果腺肋花楸黃酮對游泳前后小鼠血乳酸值的影響Table 6 Effect of the Aronia melanocarpa flavonoids to swim around the mouse blood lactate values

由表6可見，小鼠灌胃黑果腺肋花楸黃酮30 d后，在游泳前安靜狀態(tài)時，黑果腺肋花楸黃酮對小鼠體內(nèi)血乳酸含量無顯著性影響。游泳后10 min，每組小鼠血乳酸含量比游泳前有明顯提高。但和對照組相比，黑果腺肋花楸黃酮能顯著降低運動小鼠血乳酸含量，并且灌胃劑量越大，下降越明顯。游泳10 min休息20 min，再測血乳酸含量，不同劑量的黑果腺肋花楸黃酮均能顯著降低小鼠血乳酸含量。說明黑果腺肋花楸黃酮具有抗疲勞功能。

3 結論

超聲波輔助乙醇提取黑果腺肋花楸黃酮最佳工藝參數(shù)為超聲功率70 W、超聲溫度61℃、超聲時間124 min，在此條件下，黑果腺肋花楸黃酮提取率可達到95.64%。影響黑果腺肋花楸黃酮提取率因素由大到小依次為超聲溫度>超聲時間>超聲功率。小鼠經(jīng)灌胃30 d后，游泳時間顯著延長，灌胃黑果腺肋花楸黃酮濃度越高，小鼠平均游泳時間越長。試驗組和對照組比較，黑果腺肋花楸黃酮能顯著降低運動小鼠血乳酸含量，并且灌胃劑量越大，下降越明顯，不同劑量的黑果腺肋花楸黃酮均能顯著降低小鼠血乳酸含量。由此可說明黑果腺肋花楸黃酮具有抗運動疲勞功能，可為運動員開發(fā)保健抗疲勞食品提供參考。

[1] 李斌,高凝軒,劉輝,等.大孔樹脂純化黑果腺肋花楸多酚的工藝優(yōu)化[J].食品科學,2016(16):69-74

[2] Stefka V Valcheva-Kuzmanova,Miroslav Tz Eftimov,Roman Е Tashev,et al.Memory Effects Of Aronia Melanocarpa Fruit Juice In A Passive Avoidance Test In Rats[J].Folia Medica,2014,56(3):199-203

[3] Stefka V Valcheva-Kuzmanova,Anna B Beronova,Georgi Tz Momekov.Protective effect of aronia melanocarpa fruit juice in a model of cisplatin-induced cytotoxicity in vitro[J].Folia Medica,2013,55(3/4):76-79

[4]李夢莎.響應面法優(yōu)化超聲提取黑果腺肋花楸花色苷工藝的研究[J].中國釀造,2014(9):129-133

[5] 楊樺,劉振春,劉想,等.響應面優(yōu)化超聲波輔助酶法提取小米蛋白工藝研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報,2017(1):1-8

[6] Liping Feng,Yanping Cao,Duoxia Xu,et al.Influence of Sodium Alginate Pretreated by Ultrasound on Papain Properties:Activity,Structure,Conformation and Molecular Weight and Distribution[J].Ultrasonics-Sonochemistry,2016,32(9):224-230

[7] Penghui Gao,Xingye Zhou,Bo Cheng,et al.Study on Heat and Mass Transfer of Droplet Cooling in Ultrasound Wave[J].International Journal of Heat and Mass Transfer,2017,107(4):916-924

[8] 徐懷德,秦盛華.超聲波輔助提取光皮木瓜多糖及其體外抗氧化性研究[J].食品科學,2010(10):106-111

[9] 黃艷菲,彭鐮心,丁玲,等.蕎麥和商品苦蕎茶中蘆丁含量的測定[J].現(xiàn)代食品科技,2012(9):1219-1222

[10]張琪,劉慧靈,朱瑞,等.苦蕎麥中總黃酮和蘆丁的含量測定方法的研究[J].食品科學,2003(7):113-116

[11]侯學敏,李林霞,張直峰,等.響應面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J].食品科學,2013(6):124-128

[12]許暉,孫蘭萍,張斌,等.花生殼總黃酮乙醇提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2007(8):135-139

[13]徐海軍,陶文眾,彭歡歡,等.黃芪多糖和葡萄籽提取物對衰老模型小鼠負重游泳時間和血常規(guī)參數(shù)的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2015(1):158-162

[14]孟慶煥.牡丹種皮黃酮提取分離與抗氧化及抗疲勞作用研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學,2013

[15]鄭琳,劉瀟陽,周新,等.南極磷蝦油對負重游泳小鼠的抗疲勞作用[J].大連工業(yè)大學學報,2015(2):108-110

歡迎訂閱2018年《食品研究與開發(fā)》

《食品研究與開發(fā)》是由天津市食品研究所有限公司和天津市食品工業(yè)生產(chǎn)力促進中心主辦，國內(nèi)外公開發(fā)行的食品專業(yè)科技期刊，1980年創(chuàng)刊，半月刊，采用國際流行開本大16開。其專業(yè)突出，內(nèi)容豐富，印刷精美，是一本既有基礎理論研究，又包括實用技術的刊物。本刊已被“萬方數(shù)據(jù)庫”、“中文科技期刊數(shù)據(jù)庫”、《烏利希期刊指南》、美國《化學文摘》、英國國際農(nóng)業(yè)與生物科學研究中心（CABI）、英國《食品科技文摘》（FSTA）等知名媒體收錄，并被列入“中文核心期刊”、“中國科技核心期刊”、RCCSE中國核心學術期刊（A）。主要欄目有：基礎研究、分離提取、研發(fā)與工藝、標準與檢測、生物工程、營養(yǎng)保健、貯藏保鮮、質(zhì)量安全、專題論述、食品機械等。

本刊國內(nèi)統(tǒng)一刊號CN 12-1231/TS；國際刊號ISSN 1005-6521；郵發(fā)代號：6-197。全國各地郵局及本編輯部均可訂閱。從本編輯部訂閱全年刊物享八折優(yōu)惠。2018年定價：30元/冊，全年720元。

本編輯部常年辦理郵購，訂閱辦法如下：

（1）郵局匯款。地址：天津市靜?？h靜海經(jīng)濟開發(fā)區(qū)南區(qū)科技路9號；收款人：《食品研究與開發(fā)》編輯部；郵政編碼：301600。

（2）銀行匯款。開戶銀行：工商銀行靜海支行

賬號：0302095119300204171；單位：天津市食品研究所有限公司。

《食品研究與開發(fā)》編輯部

E-mail：tjfood@vip.163.com

電話（傳真）：022-59525671

Study on Ultrasonic Assisted Extraction of Flavonoids from Aronia melanocarpa and Its Anti-exercise Fatigue

LI Rui-fang
（Zhengzhou University of Industry Technology，Zhengzhou 450000，Henan，China）

The single factor and response surface method was used to optimize the ultrasonic extraction of flavonoids from Aronia melanocarpa.The anti-fatigue effect of the flavonoids of Aronia melanocarpa was studied by mouse experiment.The results showed that the optimal extraction parameters was ultrasound power 70 W，ultrasonic temperature 61℃，and ultrasonic time 124 min.The extraction rate of flavonoids was 95.64%.The factors influencing the extraction rate of flavonoids from Aronia melanocarpa was ultrasonic temperature>ultrasonic time>ultrasonic power from strong to weak.After mice fed with flavonoids，the exhaustive swimming time of the mice was significantly prolonged and the higher the concentration the more obvious，the blood lactic acid content was compared with that of the non-perfused flavonoids group.Flavonoids of Aronia melanocarpa on mice had strong anti-exercise fatigue function.

response surface；ultrasound；Aronia melanocarpa；flavonoids；anti-fatigue

2017-01-20

李瑞芳（1984—），女（漢），講師，碩士，研究方向：體育運動保健。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.014