胡椒黃酮的提取及其抗氧化性研究

趙丹丹，陳盛余，凌紹明，謝瑜，曾小月

（廣西高校桂西生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，百色學(xué)院，廣西百色533000）

胡椒黃酮的提取及其抗氧化性研究

趙丹丹，陳盛余*，凌紹明，謝瑜，曾小月

（廣西高校桂西生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，百色學(xué)院，廣西百色533000）

研究胡椒中黃酮類化合物的提取工藝及其抗氧化性。分別考察單因素料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間的影響，并在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。結(jié)果表明，胡椒黃酮的最佳提取工藝為料液比為1∶35（g/mL），乙醇濃度為80%，提取溫度75℃，提取時(shí)間為2 h。在最佳條件下，胡椒黃酮的提取率達(dá)到3.68%；胡椒黃酮是一種有效的自由基清除劑，對(duì)DPPH·有顯著的清除作用。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度增大而增大，最高可達(dá)98.7%。

胡椒；黃酮；提?。豢寡趸?/p>

胡椒是常見(jiàn)的調(diào)味品之一，在日常生活中被廣泛使用[1]。研究表明，胡椒除了可以作為香料使用之外還具有良好的藥用功效[2]，比如抗氧化、降血脂、消炎等作用[3-5]。胡椒的藥用功效主要是因?yàn)槠浜卸喾N活性成分[2，6]，因此提取胡椒活性成分對(duì)胡椒的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

目前已經(jīng)有學(xué)者對(duì)提取胡椒活性成分進(jìn)行了研究。比如侯文潔[7]以甲醇做溶劑并采用傳統(tǒng)回流法從胡椒中提取胡椒堿，并優(yōu)化了提取工藝。除了生物堿，胡椒中還含有黃酮類物質(zhì)[6，8]，而有關(guān)胡椒黃酮的提取工藝研究報(bào)道并不多，因此本研究采用正交試驗(yàn)法對(duì)胡椒黃酮的提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究，考察工藝參數(shù)與黃酮提取量的相關(guān)性。而不同條件下得到的黃酮化合物的具體藥用功效是不一樣的，鑒于此研究還對(duì)胡椒黃酮提取物清除DPPH自由基的作用進(jìn)行了初步研究，以期進(jìn)一步掌握胡椒黃酮的抗氧化作用，為胡椒的綜合利用提供更多科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

蘆丁對(duì)照品：上海雅吉生物科技有限公司；白胡椒：百色市右江區(qū)金三角市場(chǎng)；DPPH試劑：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等分析純；試驗(yàn)用水為一次蒸餾水。

1.1.2 儀器

BSA224S型分析天平：賽多利斯公司；DF-2數(shù)顯集熱式磁力攪拌器：金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；800型離心沉淀機(jī)：上海手術(shù)器械十廠；UV-2700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取2.5 mg蘆丁用甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中。精密吸取 0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL至于6個(gè)10 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液0.5 mL，搖勻靜置5 min，分別加入10%Al（NO3）3溶液0.5mL，搖勻靜置5min，分別加入4%NaOH溶液2mL，搖勻靜止15 min分別測(cè)定510 nm的吸光度[9]。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)X，吸光度為縱坐標(biāo)Y，求得線性回歸方程為 Y=0.067 1 X+0.005，r=0.999 3。

1.2.2 樣品液制備

稱取5.00 g胡椒，按比例加入一定量的乙醇溶液浸泡12 h，在一定溫度下回流提取一定時(shí)間，抽濾，濃縮，再用乙醇定容為50 mL。取定容好的提取液1.00mL，按照“1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”的方法測(cè)定吸光度并計(jì)算黃酮提取率。

提取率/%=（樣品液總黃酮量/胡椒樣品量）×100

1.2.3 胡椒黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用[10]

將最優(yōu)條件下的胡椒黃酮提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、真空干燥后用無(wú)水乙醇配制成不同濃度的黃酮提取物溶液。稱取DPPH試劑5.0 mg，用無(wú)水乙醇定容在250mL容量瓶中備用。在不同具塞試管中加入2mL DPPH溶液，并分別加入不同濃度的黃酮提取液2 mL，搖勻，待30 min后測(cè)定517 nm的吸光度As；用2 mL DPPH與2 mL乙醇做對(duì)照試驗(yàn)，測(cè)得其吸光度Ar；用2 mL樣品液與2 mL溶劑混合后測(cè)定其吸光度A0。計(jì)算DPPH自由基的清除率（Y），計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比的影響

在乙醇濃度為95%，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為3 h條件下，分別試驗(yàn)不同料液比對(duì)黃酮提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 料液比的影響Fig.1 The effects of solid-to-liquid ratio

由圖1可知，當(dāng)溶劑用量增多時(shí)，總黃酮提取率增加，在料液比 1 ∶10（g/mL）變化到 1 ∶30（g/mL）時(shí)，黃酮提取率增加比較明顯；當(dāng)料液比從1∶30（g/mL）變化到1∶50（g/mL）時(shí)總黃酮提取率雖然有增加，但是增加的量很有限。這說(shuō)明胡椒黃酮在乙醇溶液的溶解度是有一定限度的，需要一定量的溶劑才能將大部分黃酮溶出。從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)選擇1∶30（g/mL）的料液比比較合適。

2.2 乙醇濃度的影響

在料液比為 1∶30（g/mL），提取溫度為 80℃，提取時(shí)間為3 h條件下，分別試驗(yàn)不同濃度乙醇對(duì)黃酮提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

當(dāng)乙醇濃度增大時(shí)，黃酮提取率先增大后減小，乙醇濃度增大溶劑的極性會(huì)下降，因此，胡椒中的極性黃酮物質(zhì)的溶出量會(huì)下降，但是弱極性黃酮的溶解度會(huì)增加。這兩者對(duì)總黃酮的提取率影響是一個(gè)矛盾關(guān)系，在這兩者之間選取一個(gè)合適的乙醇濃度可以使極性黃酮和弱極性黃酮都有一個(gè)合適的溶解度，并使總黃酮的溶解度有最大值。在圖2中可以看出，選擇80%的乙醇對(duì)總黃酮提取率較好。

圖2 乙醇濃度的影響Fig.2 The effects of ethanol concentration

2.3 提取溫度的影響

在料液比為1∶30（g/mL），乙醇濃度為80%，提取時(shí)間為3 h條件下，分別試驗(yàn)不同溫度對(duì)黃酮提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 溫度的影響Fig.3 The effects of extraction temperature

由圖3可知，在70℃之前，黃酮提取率隨溫度升高而增大，溫度超過(guò)70℃之后隨溫度升高而降低。這是由于在70℃之前，黃酮隨著溫度的升高溶解度增大，加熱有利于進(jìn)一步促使黃酮溶出；而當(dāng)溫度大于70℃之后，由于溫度過(guò)高可能會(huì)促使部分黃酮分解，或者發(fā)生其它反應(yīng)，所以圖3曲線在70℃之后會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并且溫度越高，提取率下降越明顯。為了使胡椒黃酮的提取達(dá)到較好效果，選擇70℃的提取溫度。

2.4 提取時(shí)間的影響

在料液比為 1 ∶30（g/mL），乙醇濃度為 80%，提取溫度為70℃的條件下，分別試驗(yàn)不同提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 時(shí)間的影響Fig.4 The effects of extraction time

由圖4可以知，提取時(shí)間為2 h，黃酮提取率有最大值。當(dāng)時(shí)間小于2 h，加熱時(shí)間的延長(zhǎng)可以促進(jìn)黃酮類物質(zhì)從胡椒中溶解出來(lái)；當(dāng)加熱時(shí)間大于2 h時(shí)，黃酮物質(zhì)可能會(huì)在長(zhǎng)時(shí)間加熱條件下發(fā)生分解反應(yīng)，所以圖4的提取率曲線在2 h后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。從提取率出發(fā)，選擇2 h的提取時(shí)間比較合適。

2.5 正交試驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上，選擇料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levers of orthogonal tests

表2L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2L9（34）Orthogonal experimental design and results

由表2的結(jié)果可以知道RC>RD>RB>RA，所以各因素對(duì)黃酮提取率的影響大小順序?yàn)樘崛囟?提取時(shí)間>乙醇濃度>料液比。由均值K大小對(duì)比可以知道，最佳提取工藝為A3B2C3D2，即料液比為1∶35（g/mL），乙醇濃度為80%，提取溫度75℃，提取時(shí)間為2 h。

2.6 正交結(jié)果驗(yàn)證

選擇正交試驗(yàn)優(yōu)化的工藝進(jìn)行提取，平行測(cè)定5份，得到該工藝下的黃酮平均提取率為3.68%，該結(jié)果明顯比前面的提取率高，說(shuō)明該優(yōu)化工藝是最優(yōu)工藝。

2.7 不同濃度胡椒黃酮對(duì)DPPH·的清除作用

不同濃度胡椒黃酮對(duì)DPPH·的清除作用見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度胡椒黃酮對(duì)DPPH·的清除作用Fig.5 The scavenging effect of different concentrations of pepper flavonoids on DPPH·

胡椒黃酮提取液對(duì)DPPH自由基的清除率越大，其抗氧化活性就越強(qiáng)，反之就越弱[10]。由圖5可知，不同濃度的胡椒黃酮對(duì)DPPH·的清除作用并不相同，當(dāng)胡椒黃酮濃度增大其對(duì)DPPH·的清除率增大，黃酮濃度為60 μg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到98.7%。這說(shuō)明胡椒黃酮具有抗氧化性，其抗氧化性隨著濃度增大而增強(qiáng)，這與金蓮花[11]、木瓜[12]相似。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)得到提取胡椒黃酮的最佳工藝條件為料液比為1∶35（g/mL），乙醇濃度為80%，提取溫度75℃，提取時(shí)間為2 h，在該工藝條件下，胡椒黃酮的提取率達(dá)到3.68%。試驗(yàn)采用乙醇溶液作為溶劑主要是因?yàn)辄S酮類化合物易溶于乙醇溶液；黃酮的提取率收多種因素的影響，因此試驗(yàn)選擇了4個(gè)主要因素進(jìn)行研究，各因素之間還存在一定的相互作用，所以在單因素基礎(chǔ)上增加了正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的結(jié)果表明了正交試驗(yàn)的工藝更加適合提取胡椒黃酮。各種植物提取的黃酮物質(zhì)都有一定區(qū)別，因此對(duì)胡椒黃酮提取物清除DPPH·作用進(jìn)行研究可以考察其抗氧化能力。研究結(jié)果表明胡椒黃酮對(duì)DPPH·具有一定的清除作用，在黃酮濃度10 μg/mL～60 μg/mL范圍內(nèi)，其清除DPPH·作用隨濃度的增大而增強(qiáng)。這也說(shuō)明在該濃度范圍內(nèi)其抗氧化作用也是如此，這也證明胡椒黃酮具有潛在的藥用價(jià)值，但是目前還很少對(duì)胡椒黃酮的進(jìn)行實(shí)際開(kāi)發(fā)利用。因此本研究得到的提取方法有望應(yīng)用于胡椒黃酮的提取，并進(jìn)一步推動(dòng)胡椒的開(kāi)發(fā)利用。

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Extraction and Anti-oxidation Property of Flavones from Peppers

ZHAO Dan-dan，CHEN Sheng-yu*，LING Shao-ming，XIE Yu，ZENG Xiao-yue
（Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Regional Ecological Environment Analysis and Pollution Control of West Guangxi，Baise University，Baise 533000，Guangxi，China）

The extraction of flavonoids from peppers was studied and the antioxidant activity of the extract was evaluated as well.The effects such as solid-to-liquid ratio，ethanol concentration，extraction temperature and extraction time were investigated respectively.Based on single-factor experiments，orthogonal experiment of four factors and three levels were studied.The results showed that optimum extraction process were solid-to-liquid ratio of 1 ∶35（g/mL），ethanol concentration of 80%，extraction temperature of 75 ℃ and extraction time of 2 hours.The extraction rate of flavonoids could reach 3.68%under the optimum conditions.The flavonoids from peppers was a kind of effective free radical scavenger which had significant scavenging effect on DPPH·.The elimination rate rose with the increasing flavonoids concentration.It could reach the highest value of 98.7%.

peppers；flavonoids；extraction；anti-oxidation

2016-10-09

廣西大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201610609057）；百色學(xué)院校級(jí)科學(xué)研究項(xiàng)目基金資助（2015KBN06）；百色學(xué)院校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201610609118）

趙丹丹（1985—），女（漢），講師，碩士，從事藥物分析和電分析化學(xué)研究。

*通信作者：陳盛余（1984—），講師。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.013