熱處理對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用

鄒忠義，黃斐，孫建利，馮志，石瑞婷，李洪軍

（1.公安海警學(xué)院后勤管理系，浙江寧波315801；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400716）

熱處理對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用

鄒忠義1，黃斐1，孫建利1，馮志1，石瑞婷1，李洪軍2，*

（1.公安海警學(xué)院后勤管理系，浙江寧波315801；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400716）

研究熱處理對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和T-2毒素的去除作用。測試不同溫度、不同加熱時(shí)間、不同pH值條件下熱處理對DON和T-2毒素影響，采用高效液相色譜-質(zhì)譜測定毒素及其衍生物，采用外標(biāo)法定量。DON在中酸性條件下，121℃加熱60 min，DON濃度保持穩(wěn)定，堿性條件能促進(jìn)DON的熱降解。T-2毒素在中酸性條件下，105℃加熱30 min開始降解，121℃處理pH值為7的1.0 μg/mL T-2毒素溶液60min，T-2毒素去除率分別為（51.98±3.37）%，堿性條件能促進(jìn)T-2毒素的熱降解。在一定條件下，熱處理對DON、T-2毒素具去除作用。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）；T-2毒素；熱處理；去除

單端孢霉烯族毒素（trichothecenes）是由鐮刀菌等產(chǎn)生的一類真菌毒素[1]，它包含多種毒素，其中最具有代表性是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和T-2毒素[2-3]，對人和動(dòng)物具有多種毒性[4-5]。它們廣泛存在于各種環(huán)境中[6]，目前還沒有完全有效的適宜去除方法，給糧食和飼料產(chǎn)業(yè)帶來大量經(jīng)濟(jì)損失，也給食品安全帶來一定隱患，所以必須采取有效的措施來控制這類毒素的污染[7]。

大多數(shù)真菌毒素在常規(guī)食品加工溫度范圍內(nèi)對熱具有抵抗力，在通常烹飪條件下，例如常壓蒸煮、巴氏滅菌，真菌毒素含量降低很少或不降低[8]。Ryu等[9]、Bullerman等[10]對這方面研究進(jìn)行了綜述，提到DON等毒素對熱穩(wěn)定，會(huì)一定程度上保留在加工后的產(chǎn)品中。本工作將研究熱處理對單端孢霉烯族毒素去的除作用，探索去除此類毒素的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DON、T-2 毒素、脫環(huán)氧 DON（deepoxy-deoxynivalenol，DOM-1）、DON-3-葡萄糖苷、15-乙酰-DON（15-acetyl-deoxynivalenol，15-A-DON）、3-乙酰-DON（3-acetyl-deoxynivalenol，3-A-DON）、T-2 四醇、T-2三醇、T-2四醇四乙酸酯、HT-2毒素、新茄病鐮刀菌烯醇（neosolaniol，NEO）（純度均≥99%）、正己烷、乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸（均為色譜純）、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要儀器

CPA225D電子天平：德國Sartorius公司；Finnpipette移液器：美國Thermo Scientific公司；XW-80A漩渦混合器：江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；S20P-K pH計(jì)：瑞士Mettler-Toledo公司；SW22恒溫振蕩器：德國JULABO公司；LABO AUTOCLANE MLS-3780高壓滅菌鍋：日本SANYO公司；SIGMA 3-30k離心機(jī)：美國Sigma-Aldrich公司；N-EVAPTM 116氮吹儀：美國Organomation Associates公司；Polytetrafluoroethylene濾膜（17 mm，0.22 μm）：丹麥 Frisenette公司。Sciex API 4000三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源及Analyst software 1.5.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）：美國Applied Biosystems公司；UFLC LC-20AD高效液相色譜儀、Shim-peak UP-ODS分離柱（150 mm×4.6 mm，3.0 μm）、Shim-peak GPRC-ODS保護(hù)柱（8 mm×1.5 mm，5.0 μm）：日本Shimadzu公司。

1.3 主要方法

1.3.1 制備毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作液

制備毒素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確分別稱取DON、T-2及其衍生物（DOM-1、15-A-DON、3-A-DON、DON-3-葡萄糖苷、T-2四醇、T-2三醇、T-2四醇四乙酸酯、HT-2、NEO）5.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品于5 mL容量瓶中，用乙腈溶解成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光-20℃條件下保存。

制備毒素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別用超純水稀釋、定容毒素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，制成0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μg/mL 的毒素、毒素衍生物及其混合物的標(biāo)準(zhǔn)工作液，避光4℃條件下保存。

制備不同pH值毒素溶液：先將超純水調(diào)節(jié)pH值為 3、5、7、9（用 0.2 mol/L 鹽酸溶液和 0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液），分別取1 mL 100.0 μg/mL的DON、T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到99 mL不同pH值水溶液中，制成1.0 μg/mL 不同 pH 值（3、5、7、9）的 DON、T-2 毒素工作液。

1.3.2 不同加熱溫度對DON和T-2毒素的影響

分別取10 mL 1.0 μg/mL pH 值為7的DON、T-2毒素工作液于25 mL具刻度玻璃試管（擰松管塞），在恒溫振蕩器和高壓滅菌鍋中，分別用80、90、100、105、110、115、121 ℃處理 30 min，處理完后，用超純水定容至10 mL，以未處理毒素溶液為對照，用HPLC-MS/MS測定毒素及其衍生物。

1.3.3 不同加熱時(shí)間對DON和T-2毒素的影響

分別取10 mL 1.0 μg/mL pH值為7的DON、T-2毒素工作液于25 mL具刻度玻璃試管（擰松管塞），在高壓滅菌鍋中，用 121 ℃分別處理 10、20、30、40、50、60 min，之后定容至10 mL，以未處理毒素溶液為對照，用HPLC-MS/MS測定毒素及其衍生物。

1.3.4 不同pH值時(shí)加熱對DON和T-2毒素的影響

分別取 10mL 不同 pH 值（3、5、7、9）的 1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液于25mL具刻度玻璃試管（擰松管塞），在121℃高壓滅菌鍋中，分別加熱60 min，之后定容至10 mL，以未處理毒素溶液為對照，用HPLCMS/MS測定毒素及其衍生物。

1.3.5 測定DON、T-2毒素及其衍生物

將待測溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾到HPLC進(jìn)樣瓶中，用HPLC-MS/MS分析。外標(biāo)法定量。

1.3.6 色譜條件[7]

流動(dòng)相：B（甲醇）；A（水，含 2mmol/L醋酸銨和0.1%甲酸）。梯度洗脫：0～5 min，5%B；5 min～6 min，5%～95%B；6 min～11 min，95%B。流速：0.3 mL/min。柱溫：40℃。進(jìn)樣量：30 μL。

1.3.7 質(zhì)譜條件[7]

掃描方式：正離子模式掃描；檢測模式：多反應(yīng)檢測；氣簾氣壓力：40 Pa（氮?dú)猓?；離子源氣體1：60 Pa（氮?dú)猓浑x子源氣體2：60 Pa（氮?dú)猓?；離子源溫度：650℃；界面加熱器：ON；電噴霧電壓：5 500.00 V；碰撞氣壓力：10 Pa（氮?dú)猓?；其它條件如表1所示。

表1 DON、T-2毒素及其衍生物的躍遷監(jiān)測及電噴霧離子源條件Table 1 Transitions monitored for DON，T-2 and their derivatives&ESI source conditions

表1 DON、T-2毒素及其衍生物的躍遷監(jiān)測及電噴霧離子源條件Table 1 Transitions monitored for DON，T-2 and their derivatives&ESI source conditions

1.3.8 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)處理采用Analyst software 1.5.1。用3次平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）表示結(jié)果。采用PASW Statistics 18軟件數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平0.05，采用一維方差分析差異顯著性分析，圖上標(biāo)不同大寫字母表示數(shù)值差異顯著（P＜0.05），相同大寫字母表示數(shù)值差異不顯著（P＞0.05）。

式中：R為毒素去除率，%；c0為處理前毒素濃度，μg/mL；c1為處理后毒素濃度，μg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度熱處理對DON和T-2毒素的影響

DON、T-2毒素濃度受加熱溫度的影響見圖1。

由圖1可知，pH值為7的1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液在80℃～121℃溫度范圍內(nèi)，加熱30 min，溶液中DON濃度保持穩(wěn)定；在80℃～100℃溫度范圍內(nèi)，加熱30min，溶液中T-2毒素濃度保持穩(wěn)定，在105℃～121℃溫度范圍內(nèi)，加熱30 min，溶液中T-2毒素濃度不斷降低。與對照組（未加熱處理）相比，105、110、115、121℃處理30min，T-2毒素去除率分別為（9.21±3.17）%、（10.89± 2.57）%、（12.28 ± 2.38）%、（15.94 ±2.18）%。

圖1 DON、T-2毒素濃度受加熱溫度的影響Fig.1 Effect of heating temperature on concentrations of DON and T-2 toxin

2.2 不同加熱時(shí)間對DON和T-2毒素的影響

DON、T-2毒素濃度受加熱時(shí)間的影響見圖2。

由圖2可知，在121℃加熱10 min～60 min，溶液中DON濃度保持穩(wěn)定，溶液中T-2毒素濃度不斷降低，與 0 min（未加熱處理）相比，121 ℃處理 10、20、30、40、50、60 min，T-2毒素去除率分別為（5.94±3.17）%、（10.89±2.77）%、（15.94±2.08）%、（28.32±2.18）% 、（41.58±2.67）%、（51.98±3.37）%。

圖2 DON、T-2毒素濃度受加熱時(shí)間的影響Fig.2 Effect of heating time on concentrations of DON and T-2 toxin

2.3 不同pH值條件下熱處理對DON和T-2毒素的影響

熱處理中DON濃度受pH值的影響見圖3。

圖3 熱處理中DON濃度受pH值的影響Fig.3 Effect of pH value of DON solution on DON concentration by heat treatment

由圖3可知，pH值9的未加熱處理對照溶液中DON濃度降為（0.935±0.026）μg/mL，DON去除率為（7.50±2.60）%；pH值（3、5、7）的未加熱處理對照溶液中DON濃度保持穩(wěn)定。pH值（3、5、7）的處理溶液（121℃處理60 min）中DON濃度保持穩(wěn)定；pH值9的處理溶液（121℃處理60min）中DON濃度降為（0.755±0.031）μg/mL，DON 去除率為（25.50± 3.10）%，與 pH值為9的DON對照溶液相比，DON去除率增加了（18.00±0.50）%。

熱處理中T-2毒素濃度受pH值的影響見圖4。

由圖4可知，pH值9的未加熱處理對照溶液中T-2毒素濃度降為（0.95±0.035）μg/mL，T-2毒素去除率為（5.00±3.50）%；pH值（3、5、7）的未加熱處理對照溶液中 T-2毒素濃度保持穩(wěn)定。pH 值（3、5、7、9）的處理溶液（121℃處理60 min）中T-2毒素濃度分別降為 （0.485 ± 0.021）、（0.480 ± 0.023）、（0.475 ±0.022）、（0.317±0.031）μg/mL，T-2毒素去除率分別為（51.50±2.10）%、（52.00±2.30）%、（52.50±2.20）%、（68.30±3.10）%。其中pH值9的處理組（121℃處理60 min）與pH值為9的對照組（未加熱處理）相比，T-2毒素去除率增加了（63.30±0.40）%。

圖4 熱處理中T-2毒素濃度受pH值的影響Fig.4 Effect of pH value of T-2 toxin solution on T-2 toxin concentration by heat treatment

2.4 分析熱處理DON和T-2毒素

檢測上述經(jīng)過熱處理DON、T-2毒素溶液，未發(fā)現(xiàn)毒素衍生物 DOM-1、15-A-DON、3-A-DON、DON-3-葡萄糖苷、T-2四醇、T-2三醇、T-2四醇四乙酸酯、HT-2、NEO，推測可能將其轉(zhuǎn)化為其它未知產(chǎn)物。

在本研究中，DON在中酸性（pH值為3、5、7）條件下，121℃加熱10 min～60 min，DON濃度保持穩(wěn)定，在堿性（pH值為9）條件下，未加熱處理，DON濃度降低，說明DON在堿性條件下不穩(wěn)定，Young等[13]也曾說明過這一點(diǎn)。在本試驗(yàn)中，在堿性（pH值為9）條件下121℃加熱60 min DON濃度降低，與中酸性（pH值為3、5、7）條件下121℃加熱60 min DON濃度保持穩(wěn)定相比，說明堿性條件能促進(jìn)DON的熱降解。目前關(guān)于DON的熱穩(wěn)定性研究，大多數(shù)集中在糧食及制品在熱加工過程中對DON的影響。Numanoglu等[14]研究了面包加工工藝對對面包中DON含量的影響，發(fā)現(xiàn)面包焙烤工藝能降低DON含量。Pronyk等[15]研究了過熱蒸汽對DON的去除作用，185℃過熱蒸汽以0.35 m/s速度通過小麥6 min，能去除52%的DON，特別適合干物料中DON的去除，作用方式是熱降解，而不是溶解和提取作用。Bretz等[16-17]研究了熱處理對DON、NIV的影響，在堿性條件下，DON產(chǎn)生3種已知物質(zhì)（norDON A、norDON B、norDON C）和 4 種未知物質(zhì)（norDON D、norDON E、norDON F、9-羥甲基DON內(nèi)酯），NIV產(chǎn)生了4種產(chǎn)物norNIV A、norNIV B、norNIVC、NIV 內(nèi)酯，同時(shí)用永生人類腎臟上皮（IHKE）細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)物的細(xì)胞毒性要低于原形DON、NIV。

在本研究中，T-2毒素在堿性（pH值為9）條件下未加熱處理，濃度降低，說明T-2毒素在堿性條件下不穩(wěn)定，這和DON類似。T-2毒素中酸性（pH值為3、5、7）條件下 105℃～121℃加熱 30 min～60 min，T-2 毒素濃度降低，說明T-2毒素在中酸性（pH值為3、5、7）條件下熱穩(wěn)定要低于DON。在堿性（pH值為9）條件下121℃加熱60 min，T-2毒素的去除率要高于在中酸性（pH值為3、5、7）條件下121℃加熱60 min的去除率，說明堿性條件能促進(jìn)T-2毒素的熱降解。目前關(guān)于T-2毒素的熱穩(wěn)定性研究報(bào)道不多，僅Beyer等[18]研究T-2毒素在加熱條件下與α-D-葡萄糖的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)生成3種產(chǎn)物，用永生人類腎臟上皮（IHKE）細(xì)胞做毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的細(xì)胞毒性要低于T-2毒素。

在本研究中，毒素類型、熱處理溫度、熱處理時(shí)間、毒素溶液pH值對DON、T-2毒素?zé)峤到庑Ч绊懞艽?，這和Samaraeva等[19]、Rustom等[20]的研究結(jié)果類似，他們研究發(fā)現(xiàn)，在熱降解AF中，AF的類型、加熱溫度和時(shí)間、熱穿透力、水分含量、pH值、離子強(qiáng)度，在熱降解中起著重要作用。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明在一定條件下熱處理對DON、T-2毒素具去除作用，去除效果受到毒素類型、熱處理溫度、熱處理時(shí)間、毒素溶液pH值的影響。因此，在一定條件下，可考慮將熱處理方法作為去除該類毒素的一種措施。

[1] HE Jianwei,ZHOU Ting,YOUNG J C,et al.Chemical and biological transformations for detoxification of trichothecene mycotoxins in human and animal food chains:a review[J].Trends in Food Science&Technology,2010,21(2):67-76

[2] 鄒忠義,賀稚非,李洪軍,等.畜禽產(chǎn)品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素殘留分析[J].食品科學(xué),2013,34(14):208-211

[3] EFSA.Opinion of the scientific panel on contaminants in the food chain on a request from the commission related to deoxynivalenol(DON)as undesirable substance in animal feed (Question No EFSA-Q-2003-036)[J].The EFSA Journal,2004,73:1-42

[4] MORGAVI D P,RILEY R T.Fusarium and their toxins:mycology,occurrence,toxicity,control and economic impact[J].Animal Feed Science and Technology,2007,137(3/4):199-200

[5] PESTKA J J,SMOLINSKI A T.Deoxynivalenol:toxicology and potential effects on humans[J].Journal of Toxicology and Environmental Health,Part B,Critical Reviews,2005,8(1):39-69

[6]SHAPIRA R,PASTER N.Control of mycotoxins in storage and techniques for their decontamination.Mycotoxins in Food:Detection and Control[M].Abington:CRC Press,2004:190-223

[7] 鄒忠義,黃斐,李洪軍,等.紫外光輻照對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用[J].食品科學(xué),2015,36(19):7-11

[8]ZAKI M M,EL-MIDANY S A,SHAHEEN H M,et al.Mycotoxins in animals:Occurrence,effects,prevention and management[J].Journal of Toxicology and Environmental Health Sciences,2012,4(1):13-28

[9]RYU D,BIANCHINI A,BULLERMAN L B.Effects of processing on mycotoxins[J].Stewart Postharvest Review,2008,4(6):1-8

[10]BULLERMAN L B,BIANCHINI A.Stability of mycotoxins during food processing[J].International Journal of Food Microbiology,2007,119(1/2):140-146

[11]ZHOU Ting,HE Jianwei,GONG J.Microbial transformation of trichothecene mycotoxins[J].World Mycotoxin Journal,2008,1(1):23-30

[12]ZAKI M M,EL-MIDANY S A,SHAHEEN H M,et al.Mycotoxins in animals:occurrence,effects,prevention and management[J].Journal of Toxicology and Environmental Health Sciences,2012,4(1):13-28

[13]YOUNG J C,BLACKWELL B A,APSIMON J W.Alkaline degradation of themycotoxin 4-deoxynivalenol[J].Tetrahedron Letters,1986,27(9):1019-1022

[14]NUMANOGLU E,G?KMEN V,UYGUN U,et al.Thermal degradation of deoxynivalenol during maize bread baking[J].Food Additives&Contaminants:Part A,2011,29(3):423-430

[15]PRONYK C,CENKOWSKI S,ABRAMSON D.Superheated steam reduction of deoxynivalenol in naturally contaminated wheat kernels[J].Food Control,2006,17(10):789-796

[16]BRETZ M,BEYER M,CRAMER B,et al.Thermal degradation of the Fusarium mycotoxin deoxynivalenol[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(17):6445-6451

[17]BRETZ M,KNECHT A,G?CKLER S,et al.Structural elucidation and analysis of thermal degradation products of the Fusarium mycotoxin nivalenol[J].Molecular Nutrition&Food Research,2005,49(4):309-316

[18]BEYER M,FERSE I,MULAC D,et al.Structural elucidation of T-2 toxin thermal degradation products and investigations toward their occurrence in retail food[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(5):1867-1875

[19]SAMARAEVA U,SEN A C,COHEN M D,et al.Detoxification of aflatoxins in foods and feeds by physical and chemical methods[J].Journal of Food Protection,1990,53(6):489-501

[20]Rustom I Y S.Aflatoxin in food and feed:occurrence,legislation and inactivation by physical methods[J].Food Chemistry,1997,59(1):57-67

Removal of Deoxynivalenol and T-2 Toxin by Thermal Treatment

ZOU Zhong-yi1，HUANG Fei1，SUN Jian-li1，F(xiàn)ENG Zhi1，SHI Rui-ting1，LI Hong-jun2，*
（1.Department of Logistics Management，China Maritime Police Academy，Ningbo 315801，Zhejiang，China；2.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China）

The effects of temperature，thermal time and pH value of toxin solutions on the removal of deoxynivalenol（DON）and T-2 toxin by thermal treatment were investigated.The concentration of toxins and their derivatives were analyzed by HPLC-MS/MS and quantified by external standard method.DON remained stable at 121℃for 60 min in neutral or acidic condition，but alkaline condition promoted thermal degradation of DON.T-2 toxin was degraded at 105℃ for 30 min in neutral or acidic condition，and removal rate of T-2 toxin was（51.98±3.37）%after 60 min of 121 ℃（pH value of toxin solution was 7，and concentration of toxin wase 1.0 μg/mL），and alkaline condition promoted thermal degradation of T-2 toxin.DON and T-2 toxin were removed by thermal treatment under certain conditions.

deoxynivalenol（DON）；T-2 toxin；thermal treatment；removal

2016-09-17

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2009CB118806）；寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014A610190）；公安海警學(xué)院科研發(fā)展基金項(xiàng)目（2013XYPYZ013）

鄒忠義（1982—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品科學(xué)與工程。

*通信作者

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.002