抗腫瘤化合物告達(dá)亭的早期毒性機(jī)制研究

唐紅艷+胡思揚(yáng)+張家雯+施佳玉+吳小雨+張閃+張曉涵+彭顆紅+周暢

摘 要 為探究告達(dá)亭（Caudatin）對(duì)雄性昆明小鼠的毒性影響，按照告達(dá)亭質(zhì)量比為5和10 mg/kg以及溶劑對(duì)照組對(duì)SPF級(jí)昆明鼠通過(guò)腹腔注射的方法，進(jìn)行為期14 d的毒理學(xué)研究.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總共30只昆明鼠，隨機(jī)分為6組，分2批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：實(shí)驗(yàn)昆明鼠在不同濃度告達(dá)亭處理14 d后體質(zhì)量無(wú)明顯變化，血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)正常，心、肝、肺、腎以及睪丸均無(wú)組織畸變.

關(guān)鍵詞 告達(dá)亭；慢性毒理實(shí)驗(yàn)；血液成分生化分析

中圖分類號(hào) R99 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2017）03-0032-05

Study on the Early Toxicity and Mechanism for Antitumor Compound Caudatin

TANG Hong-yan1， HU Si-yang 1，3， ZHANG Jia-wen 1， SHI Jia-yu1， WU Xiao-yu1，

ZHANG Shan1， ZHANG Xiao-han1， PENG Ke-hong2*， ZHOU Chang1*

（1.The National and Local Joint Engineering Laboratory of Animal Peptide Drug Development，

College of Life Science， Hunan Normal University， Changsha 410081， China；

2.Department of Gynecological Oncology， Hunan Cancer Hospital， Changsha 410013， China；

3.The High School Attached to HNU-Meixihu High School， Changsha 410205， China）

Abstract To examine the toxic effect of Caudatin on male Kunming mice， using Caudatin concentrations of 5 mg/kg， 10 mg/kg and the vehicle control group of SPF grade Kunming mice by intraperitoneal injection method， we conducted the toxicological study for a period of 14 days. These 30 Kunming mice were randomly divided into six groups， within two sub-experiments. We found that the results from these two sub-experiments are consistent with each other. There was no significant change in body weight and hematological parameters. We observed no markedly pathological change in the tissue of heart， liver， lung， kidney and testis of 30 Kunming mice after the treatment of different concentrations of Caudatin for 14 days.

Key words Caudatin； chronic toxicity test； biochemical analysis of blood components

近年來(lái)，中藥新品種逐年增加，其應(yīng)用的范圍越來(lái)越廣.關(guān)于中藥毒副作用給人體造成嚴(yán)重?fù)p害的報(bào)道時(shí)有發(fā)生，中藥的安全性成為其走向國(guó)際市場(chǎng)必須突破的瓶頸.C21甾體苷類化合物主要存在于蘿藦科中，告達(dá)亭（Caudatin）是從白首烏中分離得到的一種C21甾體苷元，分子式為C28H42O7，

其結(jié)構(gòu)式如圖1[1-2].前期研究發(fā)現(xiàn)告達(dá)亭可以體外阻滯包括AGS細(xì)胞和HeLa細(xì)胞在內(nèi)的

多種腫瘤細(xì)胞周期，起到抑制細(xì)胞增殖的作用；通過(guò)克隆形成和Tunel等實(shí)驗(yàn)證明告達(dá)亭可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡； 劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證告達(dá)亭對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的遷移速率有顯著的抑制作用[3-5].告達(dá)亭在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、化療藥物增效減毒等方面具有重要的生物活性[6].但是到目前為止，未見(jiàn)有關(guān)告達(dá)亭藥物毒性的報(bào)道.中藥有效成分在開(kāi)發(fā)成新藥前對(duì)其有效性及安全性做出初步評(píng)價(jià)必不可少，早期毒性指標(biāo)的發(fā)現(xiàn)對(duì)于藥物毒性的早期預(yù)警尤為重要.本論文采用模式生物小鼠做為研究對(duì)象，首次對(duì)告達(dá)亭是否影響小鼠血清生化指標(biāo)以及臟器毒理關(guān)系進(jìn)行了研究，為臨床合理用藥提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

告達(dá)亭購(gòu)于深圳美荷生物公司，戊巴比妥納、苦味酸、乙二胺四乙酸（K2-EDTA）等為上海生工的進(jìn)口分裝試劑.所用儀器有五分類血液細(xì)胞分析儀BC-5500（Mindray 公司），倒置顯微鏡CX-41（Zeiss公司）等.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6周齡雄性昆明鼠30只，健康狀況良好，體質(zhì)量為35～40 g，購(gòu)自斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

1.3 動(dòng)物分組及告達(dá)亭劑量

將30只雄性昆明鼠隨機(jī)分為6組，每組5只，用全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，培養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫：22～24 ℃，濕度：50%～64%.實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，每次15只小鼠，分3組.于每日上午8～9時(shí)分別以5和10 mg/kg及等容量溶劑腹腔注射，對(duì)照組所注射的溶劑為丙二醇和PEG400按照體積比1∶9 配制，再用水稀釋至總體積占比20%，過(guò)濾滅菌.

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 行為觀察及體重檢測(cè) 每天進(jìn)行一般觀察的項(xiàng)目，包括小鼠精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、糞便性狀、腺體分泌、皮膚被毛等.隔日稱取體質(zhì)量，進(jìn)行監(jiān)測(cè).

1.4.2 血清生化指標(biāo)的檢測(cè) 末次給藥24 h后，對(duì)小鼠腹腔注射1%戊巴比妥納進(jìn)行麻醉，所有小鼠均用眼眶下采血法收取血液，先取1.5 mL血液樣本按照1∶100 的比例加入10% K2-EDTA 抗凝劑.取2 mL血液樣本，自然凝固后，檢測(cè)肌酐（CREA）、膽固醇（CHOL）、總蛋白（TP）、甘油三酯（TG）、尿酸（UA）等血清生化指標(biāo).檢測(cè)血液學(xué)指標(biāo)包括紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）、紅細(xì)胞容積（HCT）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差（RDW-SD）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（RDW-CV）、白細(xì)胞數(shù)（WBC）、血小板壓積（PCT）、血小板數(shù)（PLT）、血小板平均體積（MPV）、血小板分布寬度（PDW）.

1.5 病理學(xué)檢查

用頸椎拉斷法處死小鼠后尸解，取出心、肝、肺、腎和睪丸5個(gè)臟器組織，首先經(jīng) Bouin氏液固定24 h，在自來(lái)水下流水沖洗10 min.用70%，80%，90%，95%，100%各級(jí)酒精梯度脫水，每級(jí)10～30 min.用二甲苯將材料進(jìn)行透明，每次20～30 min，進(jìn)行2次.浸蠟，包埋后保存.經(jīng)切片、展片與貼片，脫蠟，染色，脫水，透明，封片，鏡下觀察并拍照[7-8].

2 結(jié)果

2.1 告達(dá)亭對(duì)雄性小鼠的影響

雄性昆明小鼠在給藥前經(jīng)SPF級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，經(jīng)為期14 d告達(dá)亭給藥處理，每次給藥后未見(jiàn)小鼠口、鼻、眼有異常分泌物.14 d 后所有小鼠行為活動(dòng)正常，精神狀態(tài)良好、毛發(fā)光潤(rùn)，未見(jiàn)糞便異常，無(wú)一例死亡.

2.2 告達(dá)亭對(duì)雄性小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的影響

體質(zhì)量增長(zhǎng)的幅度可以反映動(dòng)物機(jī)體發(fā)育是否正常，通常通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物的體質(zhì)量變化，來(lái)觀察是否存在藥物毒性[9].正常情況下，6周齡小鼠的體質(zhì)量會(huì)逐日增長(zhǎng)，若小鼠患有某些疾病，則體質(zhì)量增長(zhǎng)會(huì)受到影響.每隔一天的相同時(shí)間為實(shí)驗(yàn)鼠稱體質(zhì)量，計(jì)算平均值.統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖2，與溶劑對(duì)照組比較，5 mg/kg告達(dá)亭處理組體質(zhì)量增長(zhǎng)較快，10 mg/kg 告達(dá)亭劑量處理組的體質(zhì)量增長(zhǎng)速率基本一致，結(jié)果表明告達(dá)亭對(duì)小鼠的體質(zhì)量無(wú)明顯抑制作用.

2.3 告達(dá)亭對(duì)雄性小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

對(duì)雄性昆明小鼠連續(xù)腹腔注射給藥14 d，末次給藥24 h后，眼球取血檢測(cè)各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo).血液中各種指標(biāo)的增高或降低都與機(jī)體的健康狀態(tài)息息相關(guān)，主要血液指標(biāo)見(jiàn)表1.結(jié)果顯示，低劑量組白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)與同期溶劑對(duì)照組比較略有降低，高劑量組WBC計(jì)數(shù)與對(duì)照組比較下降明顯.白細(xì)胞的多少與身體免疫能力息息相關(guān)，可見(jiàn)告達(dá)亭在一定程度上降低了身體的免疫能力.其他組各項(xiàng)指標(biāo)與同期溶劑對(duì)照組比較，中劑量組和高劑量組都沒(méi)有顯著性差異.統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3.

2.4 告達(dá)亭對(duì)雄性小鼠血清生化指標(biāo)的影響

各組動(dòng)物血清生化指標(biāo)見(jiàn)表2，告達(dá)亭處理組與溶劑對(duì)照組比較，CREA（肌酐）、TP（總蛋白）和UA（尿酸）的檢測(cè)結(jié)果均無(wú)明顯影響.TG（甘油三酯）和CHOL（膽固醇）在告達(dá)亭低濃度組略有升高，在高濃度組又下降.統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4.

2.5 告達(dá)亭不影響雄性小鼠組織器官的發(fā)育

采取常規(guī)脫頸椎法處死實(shí)驗(yàn)鼠，解剖并仔細(xì)觀察各主要臟器，未見(jiàn)臟器萎縮、壞死等異?，F(xiàn)象.采用常規(guī)石蠟切片，然后對(duì)各組織伊紅染色，蘇木精復(fù)染，樹膠封片，鏡檢.結(jié)果如圖5所示.肺、睪丸、腎臟、心臟和肝臟組織中均未發(fā)現(xiàn)病灶情況.各組肺部結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核質(zhì)分布明顯；睪丸是機(jī)體的生殖和內(nèi)分泌器官，對(duì)照組以及5和10 mg/kg告達(dá)亭劑量處理組中小鼠睪丸的結(jié)構(gòu)正常.曲細(xì)精管管腔內(nèi)細(xì)胞層數(shù)未見(jiàn)減少，各級(jí)生精細(xì)胞排列規(guī)則、層數(shù)多，曲細(xì)精管管腔內(nèi)充滿較多精子，間質(zhì)細(xì)胞成群分布；與對(duì)照組比較，5和10 mg/kg告達(dá)亭劑量處理組腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，腎小球和腎小管輪廓清晰，未見(jiàn)異?，F(xiàn)象；心臟為循環(huán)系統(tǒng)中一個(gè)主要的器官，心內(nèi)膜切片結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，內(nèi)皮下層的結(jié)締組織較為致密，無(wú)結(jié)構(gòu)異常.告達(dá)亭劑量組與溶劑對(duì)照組相比，肝組織結(jié)構(gòu)完好，可見(jiàn)肝小葉和匯管區(qū)，無(wú)異常變化.

3 討論

藥物研發(fā)環(huán)節(jié)中需要進(jìn)行毒理學(xué)研究，淘汰因毒性問(wèn)題不適宜進(jìn)一步研發(fā)的中藥或合成化合物，有助于降低投資風(fēng)險(xiǎn)、提高研發(fā)成功率.耳葉牛皮消分布廣泛，藥用塊根具有養(yǎng)陰清熱、止咳、抗炎等功效.但它因?yàn)楹~牛皮消根蘿蘑毒素（cynanchotoxin），食用后出現(xiàn)的中毒癥狀有流涎、嘔吐、痙攣、呼吸困難、心跳緩慢等.告達(dá)亭是從耳葉牛皮消中提取出的一種C21甾體化合物，初步藥效學(xué)證實(shí)它可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，具有良好的應(yīng)用前景[10].告達(dá)亭作為耳葉牛皮消的一種衍生物，其一般毒性、毒性作用靶器官、毒性作用機(jī)制均未開(kāi)展系統(tǒng)研究.

六周齡雄性小鼠購(gòu)買后，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，稱取體質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)差別不大.隨機(jī)將小鼠分成3組， 14 d連續(xù)小鼠尾靜脈注射告達(dá)亭，注射劑量分別按0，5和10 mg/kg.14天后觀察，3組動(dòng)物全部存活，精神和運(yùn)動(dòng)未見(jiàn)異常；對(duì)照組與高劑量告達(dá)亭實(shí)驗(yàn)組小鼠平均體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)明顯差異，表明此濃度范圍內(nèi)的告達(dá)亭對(duì)體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)抑制作用；低劑量告達(dá)亭實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較平均體質(zhì)量有小幅增加，說(shuō)明低劑量告達(dá)亭可以促進(jìn)消化和吸收食物，有利于體質(zhì)量增長(zhǎng).血液學(xué)檢查RBC，HGB，HCT和RDW等發(fā)現(xiàn)，與同期溶劑對(duì)照組比較，低劑量組和高劑量組都沒(méi)有顯著性差異，變化在正常參考值范圍內(nèi).低劑量組WBC計(jì)數(shù)與對(duì)照組比較略有降低，但在正常參考值范圍內(nèi)，而告達(dá)亭高劑量組WBC計(jì)數(shù)與同期溶劑對(duì)照組比較有顯著性降低.白細(xì)胞減少與感染、毒素或藥物引發(fā)有關(guān).告達(dá)亭是否會(huì)引起白細(xì)胞持續(xù)下降，是否引起動(dòng)物乏力、食欲減退，毒性程度是否嚴(yán)重，將通過(guò)延長(zhǎng)給藥時(shí)間、增加給藥劑量等實(shí)驗(yàn)來(lái)證明.血漿生化指標(biāo)檢查發(fā)現(xiàn)，和肝功能代謝能力相關(guān)的TP，與腎功能相關(guān)的CREA和UA，以及血脂分析的常規(guī)項(xiàng)目TG和CHOL均未見(jiàn)明顯改變.進(jìn)一步觀察HE染色的組織切片發(fā)現(xiàn)各組器官均正常.高劑量組和低劑量組告達(dá)亭處理后的小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索和肝血竇均沒(méi)有變形，大小比例正常.告達(dá)亭處理組的腎小球剖面界限清晰，腎小管和間質(zhì)未見(jiàn)明顯異常.近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，生殖細(xì)胞對(duì)藥物更敏感，抗腫瘤藥物有效殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，往往引起生精細(xì)胞的大量凋亡，甚至男性生精功能急劇下降，從而導(dǎo)致不育.兩組告達(dá)亭處理組的睪丸曲細(xì)精管形狀正常，每一個(gè)曲細(xì)精管內(nèi)均見(jiàn)多層細(xì)胞，生精細(xì)胞與支持細(xì)胞數(shù)目豐富，管腔從外向內(nèi)有各級(jí)生精細(xì)胞排列規(guī)則，最內(nèi)層精子形態(tài)和數(shù)量正常.藥物組未見(jiàn)小鼠心肌萎縮、心肌斷裂、心肌出血，心肌細(xì)胞核完整.兩組告達(dá)亭處理組的肺組織是正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蘇木精復(fù)染后，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，胞核與胞漿對(duì)比鮮明，從組織形態(tài)未看出病變.綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，一定濃度的告達(dá)亭對(duì)小鼠血液系統(tǒng)以及肝、腎、睪丸、心和肺等重要器官的毒性作用很小.

在藥物的毒性反應(yīng)中還須考慮神經(jīng)毒性.藥物產(chǎn)生的神經(jīng)毒性會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)，有可能造成包括藥物成癮在內(nèi)的諸多不良后果.據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有10%的新藥因?yàn)樯窠?jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)而不能面市[11-13].因此下一步將著重研究告達(dá)亭是否會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性，并研究告達(dá)亭對(duì)雌性小鼠有無(wú)生殖毒性.另外，遺傳毒理學(xué)也是目前新興的一項(xiàng)毒理實(shí)驗(yàn)研究學(xué)，筆者想從中藥抗誘變性的角度研究告達(dá)亭是否起中藥抗誘變性作用，能否與其他成熟的化療藥物配合使用，降低化療藥物的劑量，達(dá)到更好的治療效果.

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