基于“多基因聚合-早世代組配”策略的水稻分子改良研究

陳立凱，郭 濤，劉永柱，王 慧，陳志強(qiáng)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

基于“多基因聚合-早世代組配”策略的水稻分子改良研究

陳立凱，郭 濤，劉永柱，王 慧，陳志強(qiáng)

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

傳統(tǒng)水稻育種技術(shù)最主要瓶頸是選擇效率低和周期長(zhǎng)。為了提高水稻優(yōu)異材料選育和雜交稻組配效率，創(chuàng)新水稻分子育種策略，利用分子標(biāo)記輔助選擇多基因聚合和早世代雜交組配，展開水稻恢復(fù)系分子改良和雜交新組合的調(diào)查評(píng)價(jià)。供體親本H318與恢復(fù)系親本華占進(jìn)行雜交，通過選擇和設(shè)計(jì)關(guān)鍵有利基因的分子標(biāo)記，利用毛細(xì)管電泳基因分型技術(shù)，將Wxb、fgr、Xa23、Pi2、Pi46以及Pita6個(gè)稻米品質(zhì)、香味、抗白葉枯病和抗稻瘟病相關(guān)功能基因進(jìn)行聚合利用。通過多世代的田間生物學(xué)性狀調(diào)查，米質(zhì)、抗性等表型鑒定，獲得14份以恢復(fù)系華占為遺傳背景，目標(biāo)基因純合的優(yōu)質(zhì)、雙抗和香型穩(wěn)定的水稻株系。依據(jù)材料穩(wěn)定遺傳特性，將改良后代株系與生產(chǎn)應(yīng)用的不育系進(jìn)行測(cè)配和組合的調(diào)查評(píng)價(jià)，篩選獲得潛在優(yōu)良雜交稻。在育種進(jìn)程中采用“多基因聚合-早世代組配”策略，實(shí)現(xiàn)多個(gè)有利基因快速聚合，定向改良稻米品質(zhì)和抗病性等關(guān)鍵性狀，并且促進(jìn)雜交水稻組合的高效選育。

水稻；分子改良；多基因聚合；雜交組配；恢復(fù)系

中國(guó)是世界上最大的水稻生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，雜交水稻的成功培育，為保障糧食的安全供給做出了巨大貢獻(xiàn)[1]。傳統(tǒng)的育種手段中，對(duì)于優(yōu)良性狀的選擇主要是依賴個(gè)體的表現(xiàn)型，選擇效率偏低[2]。近年來，分子輔助選擇(MAS)技術(shù)與傳統(tǒng)育種手段相結(jié)合，在育種低世代完成標(biāo)記的輔助選擇過程，大大縮短育種周期[2]。結(jié)合水稻傳統(tǒng)育種的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，充分借助各種新型有效的分子育種技術(shù)，從而搭建水稻高效生物育種技術(shù)體系，已成為國(guó)際水稻育種主流趨勢(shì)[3]。不同基因位點(diǎn)的聚合改良受到育種家的普遍推崇[4]，對(duì)于多個(gè)控制水稻不同優(yōu)良性狀的基因或QTL同時(shí)雜交導(dǎo)入親本受體，實(shí)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)有利等位基因的高效聚合，可以達(dá)到綜合改良水稻多個(gè)重要性狀的育種目標(biāo)[5-9]。與傳統(tǒng)育種技術(shù)比較，分子設(shè)計(jì)育種能夠?qū)崿F(xiàn)從“經(jīng)驗(yàn)育種”到“定向、高效、精確育種”的轉(zhuǎn)變[10]。

在雜交育種中，不育系和恢復(fù)系的選擇是配置強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。以恢復(fù)系為著手點(diǎn)，選育高抗稻瘟病的恢復(fù)系對(duì)于培育抗病優(yōu)質(zhì)雜交稻具有重要的意義[12]。周黎軍等[12]研究表明，利用水稻早世代穩(wěn)定親本進(jìn)行水稻恢復(fù)系的選育在時(shí)間和方法上都可能取得重大突破。利用早世代穩(wěn)定親本作為多基因聚合的快速穩(wěn)定載體，在雜交后代早世代中發(fā)現(xiàn)和獲得穩(wěn)定株系，并通過分子標(biāo)記輔助選擇手段檢測(cè)恢復(fù)性分子標(biāo)記位點(diǎn)，田間鑒定配合力，是一種恢復(fù)系選育的新途徑[12]。

Wx和fgr基因分別調(diào)控水稻直鏈淀粉含量和香氣形成[13]。稻米的直鏈淀粉含量是影響稻米食用口感最重要的因素之一，研究表明Wx基因?qū)τ诘久字辨湹矸酆康母叩途哂袥Q定性的作用[13]。香味是高品質(zhì)稻米的一個(gè)重要特性，香稻因其優(yōu)良的香味品質(zhì)為人們所喜愛，在國(guó)際稻米市場(chǎng)中占有重要地位，稻香味性狀和香稻育種的研究也日益受到重視。稻米香味性狀育種選擇環(huán)節(jié)中，最直接有效的是直接對(duì)香味基因型進(jìn)行選擇，香味功能基因的鑒定和功能性分子標(biāo)記的出現(xiàn)為這種直接選擇提供了可能[14-15]。稻瘟病(PyricutariaoryzaeCav.)和白葉枯病(Xanthomonascampestrispv.oryzae)分別是世界范圍內(nèi)對(duì)水稻生產(chǎn)危害最嚴(yán)重的真菌性病害和細(xì)菌性病害[16]，給水稻的生產(chǎn)造成極大的危害，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)斐山^收。實(shí)踐證明，在眾多的防治措施中抗病品種的培育和種植是控制該病害最為經(jīng)濟(jì)、安全和有效的方法[8，11，17]。目前已報(bào)道的白葉枯抗病基因及稻瘟病抗性基因分別有38，83個(gè)[7]。Xa23是已報(bào)道對(duì)白葉枯抗性最好的基因之一，其對(duì)10個(gè)菲律賓小種、3個(gè)日本小種以及7個(gè)中國(guó)小種都表現(xiàn)出很好的抗性[7]。Pi46、Pi2和Pita基因是3個(gè)顯性廣譜抗稻瘟病基因，對(duì)我國(guó)各稻區(qū)菌株表現(xiàn)廣譜抗性[11，17-19 ]。應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇聚合多個(gè)抗性基因，拓寬抗譜，增強(qiáng)抗性，是培育具有持久抗性和綜合抗性品種的有效策略。

本研究提出“多基因聚合-早世代組配”的分子改良策略，通過選擇和設(shè)計(jì)關(guān)鍵有利基因的分子標(biāo)記，將Wxb、fgr、Xa23、Pi2、Pi46以及Pita6個(gè)稻米品質(zhì)、香味、抗白葉枯病和抗稻瘟病相關(guān)功能基因進(jìn)行聚合改良應(yīng)用；依據(jù)材料穩(wěn)定遺傳特性，將低世代改良后代株系與生產(chǎn)應(yīng)用的不育系進(jìn)行測(cè)配。對(duì)雜交組合進(jìn)行調(diào)查評(píng)價(jià)，以期促進(jìn)優(yōu)異雜交水稻組合的高效選育。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用水稻材料包括恢復(fù)系華占(含Wxb和Pi2基因)和多基因聚合系H318(含Wxb、Xa23、Pi46、Pita以及fgr基因)。2013年以華占為輪回親本進(jìn)行雜交和回交，展開基因型分析和MAS，獲得改良后代株系。用于組合測(cè)配的不育包括三系不育系寧A和兩系不育系C815S。此外，本研究等位基因分型使用的對(duì)照樣品包括：H4：Pi46；麗江新團(tuán)黑谷：pi46；粵豐新占：Wxa、pita及xa23；IR-BB 64：Wxb、Pita及Xa23；象牙香占：fgr及pi2；粵晶絲苗2號(hào)：Pi2；航恢173：Fgr、Rf3及Rf4；H4：rf3及rf4。水稻不育系C815S由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，其他材料均來自于國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源庫(kù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻田間種植和農(nóng)藝、品質(zhì)性狀調(diào)查 水稻種植于國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地(廣州)，田間管理按大田常規(guī)栽培要求實(shí)施。全生育期觀察田間株葉形態(tài)，參考《農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范 水稻》(NY/T 1300-2007)，植株成熟后隨機(jī)選取3株，調(diào)查農(nóng)藝性狀包括株高、劍葉長(zhǎng)、劍葉寬、單株穗重、穗數(shù)、實(shí)粒數(shù)、空粒數(shù)、總粒數(shù)，十粒長(zhǎng)、十粒寬、長(zhǎng)寬比，千粒質(zhì)量等。隨機(jī)取整精米100粒，逐粒目測(cè)，揀出明顯的白色不透明的堊白米粒，并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)堊白粒率；后用堊白度統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)數(shù)出堊白度，2次重復(fù)。香味測(cè)定采用KOH浸泡的感官品評(píng)法，參考Jin等[20]的操作步驟。根據(jù)農(nóng)業(yè)部部頒標(biāo)準(zhǔn)NY147-88(稻米品質(zhì)評(píng)價(jià)方法)測(cè)定直鏈淀粉含量，以直鏈淀粉占淀粉總量的百分率表示。

1.2.2 水稻抗病性鑒定 按照廣東農(nóng)科院植物保護(hù)研究所方法培養(yǎng)，接種菌液濃度為9×108個(gè)/mL。孕穗期內(nèi)，參照“剪葉法”進(jìn)行白葉枯病抗性鑒定，菌株為廣東省優(yōu)勢(shì)致病生理小種Ⅳ型菌。在田間條件下，選取播種60 d后的水稻單株，每株接種4～5片葉。21 d后調(diào)查病情，測(cè)量病斑長(zhǎng)度，并統(tǒng)計(jì)分析、分級(jí)，3組重復(fù)。病情分級(jí)按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)0～9級(jí)分級(jí)。采用自然病圃鑒定稻瘟病抗性。選擇廣東省稻作區(qū)的陽江稻瘟病鑒定圃，葉瘟和穗頸瘟的調(diào)查按國(guó)際水稻研究所的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 DNA提取和分子標(biāo)記檢測(cè) 取苗期水稻的葉片，參照磁珠法快速提取水稻總DNA[21]，并溶解于1×TE中，用NanoDrop 1000 (Thermo，USA)定量后以超純水稀釋至75 ng/μL，-20 ℃保存。PCR擴(kuò)增體系含2×PCR Reaction Mix 10 μL(含100 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L MgCl2、400 mmol/L dNTP)、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 1 μL，超純水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。本研究所用分子標(biāo)記信息見表1。參照Chen等[21]方法步驟，利用毛細(xì)管電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。

表1 分子標(biāo)記信息

注：引物序列中小寫字母的堿基為引入的錯(cuò)配堿基;帶下劃線字母的堿基為等位變異堿基。

Note：The bases of lowercase letter in the primer sequences are the introduced mismatch bases;Bases underlined are the allelic variation bases.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因分型和多基因聚合設(shè)計(jì)

本研究所利用的分子標(biāo)記，包括前人已鑒定的目標(biāo)基因連鎖標(biāo)記，與廣譜抗稻白葉枯病基因Xa23緊密連鎖的STS標(biāo)記M-Xa23、與稻瘟病主效抗病基因Pi46緊密連鎖的SSR標(biāo)記RM224和與稻瘟病抗病基因Pi2連鎖的特異分子標(biāo)記AP22。同時(shí)，利用ARMS-PCR技術(shù)[21]，針對(duì)水稻蠟質(zhì)基因Wx功能突變位點(diǎn)(G/T)設(shè)計(jì)開發(fā)了SNP分型標(biāo)記Wx-GT、稻米香味基因fgr的功能插入缺失位點(diǎn)，開發(fā)了InDel分型標(biāo)記fgr-E7-FM以及稻瘟病抗病基因Pita功能突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了SNP分型標(biāo)記Pita-GT。此外，為了輔助育性恢復(fù)力性狀的分子篩選，分別引入了2個(gè)最主要的恢復(fù)基因位點(diǎn)Rf3和Rf4的連鎖標(biāo)記。上述分子標(biāo)記的等位分型電泳圖譜如圖1所示。通過基因分析，確認(rèn)恢復(fù)系華占含Wxb和Pi2基因，多基因聚合系H318含Wxb、Xa23、Pi46、Pita以及fgr基因。

橫坐標(biāo).PCR產(chǎn)物大小；縱坐標(biāo).RFU相對(duì)熒光單位。

供體親本H318與恢復(fù)系親本華占進(jìn)行雜交，在F1中去除假雜種后與華占進(jìn)行回交。2014年晚季種植株BC1F1，利用分子標(biāo)記fgr-E7-FM、M-Xa23、RM224、AP22、Pita-GT、RM10338和RM6100檢測(cè)，確保目標(biāo)基因位點(diǎn)全部導(dǎo)入，并且同時(shí)保留恢復(fù)基因位點(diǎn)。隨后，選擇目標(biāo)基因位點(diǎn)盡多純合、農(nóng)藝性狀接近輪回親本(華占)的17個(gè)單株進(jìn)行自交收種(表2)。

2015年早季，種植回交后代BC1F2，并繼續(xù)展開分子標(biāo)記篩選。繼而獲得6個(gè)目標(biāo)基因性狀均純化同時(shí)保留2個(gè)恢復(fù)基因位點(diǎn)的株系。結(jié)合株葉型進(jìn)行農(nóng)藝性狀選擇，共14個(gè)株系入選進(jìn)行自交加代。2015年晚季形成BC1F3株系，田間性狀觀察發(fā)現(xiàn)大部分株系整體株葉形態(tài)整齊、生育期一致，表明株系內(nèi)遺傳物質(zhì)已經(jīng)較為相似、穩(wěn)定。據(jù)此，對(duì)這些株系展開農(nóng)藝性狀和米質(zhì)性狀鑒定、抗病性調(diào)查和雜交組配，篩選獲得穩(wěn)定的、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的多基因聚合改良恢復(fù)系材料。整個(gè)分子改良過程的育種程序如圖2所示。

2.2 改良恢復(fù)系的主要性狀評(píng)價(jià)

親本材料華占和H318以及多基因純化聚合改良株系的主要稻米品質(zhì)性狀如表3所示。所有多基因聚合系攜帶親本共有的Wxb等位基因，遺傳其直鏈淀粉含量低-中的優(yōu)良特性，大部分(64.3%)株系A(chǔ)C值13%～14%，最高值為18.01%，最低值10.05%。受體親本恢復(fù)系華占的fgr基因等位類型為野生型，籽粒無香味；利用供體H318導(dǎo)入fgr香味基因，后代改良株系的籽粒均鑒定獲得香味特性，各株系受環(huán)境和小部分遺傳背景影響，香氣程度有所差異。粒型方面，改良株系與親本之間的長(zhǎng)寬比差異不明顯。但是與恢復(fù)系華占相比，大部分改良株系堊白性狀有明顯改善，分別有78.6%和92.9%的株系堊白粒率和堊白度性狀降低，外觀品質(zhì)得到改良。其中，株系R-19862和R-21064兼?zhèn)涞椭辨湹矸酆俊⑾銡鉂庖约皥装淄庥^品質(zhì)優(yōu)異的特點(diǎn)，具有較大育種利用價(jià)值。

表2 多基因聚合入選回交后代單株及其基因型

注：+.攜帶優(yōu)異等位基因；H.雜合子。

Note：+.Elite allele； H.Heterozygote.

圖2 “多基因聚合-早世代組配”策略的水稻分子改良簡(jiǎn)要流程圖

14份改良株系均攜帶來自供體親本H318的白葉枯病主效抗性基因Xa23，其白葉枯病抗性鑒定結(jié)果(BC1F4)如表3所示。除了3份株系未獲得調(diào)查結(jié)果，其余11份改良株系的抗性級(jí)別均為抗，而受體親本華占的白葉枯病抗性水平則鑒定為感。結(jié)果表明，導(dǎo)入Xa23基因，能夠高效、一致地提高白葉枯病抗性水平，改良效果顯著。2016年的2個(gè)種植季節(jié)分別對(duì)改良株系(BC1F4和BC1F5)連續(xù)進(jìn)行田間自然誘發(fā)病圃的稻瘟病抗性鑒定，結(jié)果如表3所示。由表可知，恢復(fù)系華占在2016年早季稻瘟病抗性水平為中抗，2016年晚季為抗；供體親本材料H318表現(xiàn)為兩季均表現(xiàn)為抗水平。鑒定結(jié)果表明，聚合了3個(gè)稻瘟病抗病基因的13個(gè)株系抗性水平均表現(xiàn)為抗或高抗，抗性穩(wěn)定(表3)。與華占比較，改良株系抗性水平表現(xiàn)明顯提高。R-20314和R-20321兩季分別鑒定為抗和高抗；R-21064兩季均鑒定為高抗。通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)聚合Pi46、Pi2和Pita基因能有效提高受體親本的稻瘟病抗性，并且抗性水平穩(wěn)定。

表3 親本品種和改良株系主要米質(zhì)性狀和抗病性調(diào)查

注：AC.直鏈淀粉含量；LWR.長(zhǎng)寬比；PGWC.堊白粒率； DEC.堊白度；+.香味；Ⅰ.2016早季；Ⅱ.2016晚季。

Note：AC.Amylose content；LWR.Length-width ratio;PGWC.Percentage of grain with chalkiness； DEC.Degree of endosperm chalkiness;+.Indicates fragrant;Ⅰ.Early season of 2016；Ⅱ.Late season of 2016.

2.3 改良株系組配和雜交組合的表現(xiàn)

根據(jù)本研究早世代組配以提高雜交組合選育效率的策略，通過觀察BC1F3和BC1F4株系田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，將整體株葉型態(tài)趨于一致的改良株系分別與生產(chǎn)上的不育系寧A和C815S進(jìn)行組配?？疾祀s交組合F1主要的農(nóng)藝、品質(zhì)、產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)性狀，包括株高、單株穗重、有效穗數(shù)、結(jié)實(shí)率、研磨品質(zhì)和外觀品質(zhì)等，結(jié)果如表4所示。

株高方面，組配的雜交組合與CK相比有正反方向變異波動(dòng)，寧A所配組合株高增加占主要，而C815S所配組合主要表現(xiàn)株高降低。產(chǎn)量方面，大部分改良株系所配組合在千粒質(zhì)量上得到改良，特別是與C815S所組配的F1千粒質(zhì)量均高于CK。寧A/R-19862、C815S/R-20765和C815S/R-21056在總粒重明顯高于CK，分別提高了3.82%，12.48%和15.47%，表明這3個(gè)株系具有潛在的優(yōu)良高產(chǎn)配合力。結(jié)實(shí)率方面，三系不育系寧A所配組合為68.57%～85.57%。而C815S所配組合則偏低，在58.50%～73.46%。研磨品質(zhì)調(diào)查結(jié)果表明，改良株系與C815S雜交F1在精米率和整精米率均得到提高。此外，新的雜交組合在粒型和堊白的外觀品質(zhì)性狀上獲得不同類型，豐富遺傳多樣性和滿足不同品種選育需求。

3 討論

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種在縮短育種年限、提高育種效率等方面發(fā)揮了極其重要的作用[10，22-23]。然而，對(duì)于MAS改良后代的表型，其預(yù)測(cè)度一方面取決于基因的效應(yīng)水平，另一方面和分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖程度有直接關(guān)聯(lián)[21]。有利等位基因的鑒定和選擇，是有效預(yù)測(cè)評(píng)估分子改良成效的前提。本試驗(yàn)中，蠟質(zhì)基因Wx編碼顆粒淀粉合成酶(GBSS)，是控制直鏈淀粉合成的主效基因，直接影響稻米胚乳中直鏈淀粉的含量[24]。水稻香味是由于編碼甜菜醛脫氫酶基因突變所致，喪失功能的fgr基因使甜菜醛脫氫酶的作用底物2-乙?；?1-吡咯啉的代謝途徑中斷，香味物質(zhì)2-乙酰基-1-吡咯啉不斷積累，致使水稻籽粒產(chǎn)生香味[25]。白葉枯病抗性基因Xa23對(duì)現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外白葉枯病鑒別菌系都表現(xiàn)高抗，且完全顯性、全生育期抗病[26-27]。而Pi2、Pi46和Pita均為具廣譜抗性的稻瘟病顯性抗性基因，抗性都較好，已被廣泛驗(yàn)證和利用[8-9，11，18-19]。此外，本研究設(shè)計(jì)Wx、fgr和Pita基因的分子標(biāo)記，直接靶向基因內(nèi)部多態(tài)性位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)直接對(duì)目的基因的選擇?；诖?，低世代材料并未進(jìn)行稻米品質(zhì)和抗病性篩選，僅利用分子標(biāo)記選擇目標(biāo)基因，結(jié)合農(nóng)藝性狀進(jìn)行選擇。在較高代穩(wěn)定株系中進(jìn)行米質(zhì)、香味和抗病性鑒定，獲得多份同時(shí)具備雙抗、低支鏈淀粉含量的香型恢復(fù)系材料，所利用的基因和分子標(biāo)記體現(xiàn)出MAS的精準(zhǔn)性和高效率。

表4 改良株系雜交組配F1的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

注：CMS line.細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；PH.株高；PWPP.單株穗重；PNPP.單株穗數(shù)；TGW.總粒重；KGW.千粒質(zhì)量；SR.結(jié)實(shí)率；BRR.糙米率；MRY.精米率；HRY.整精米率；GL.粒長(zhǎng)；GW.粒寬；LWR.長(zhǎng)寬比；PGWC.堊白粒率；DEC.堊白度。

Note： CMS line.Cytoplasmic male-sterile line; PH.Plant height;PWPP.Panicles weight per plant; PNPP.Panicles number per plant; TGW.Total grain weight; KGW.1000 grain weight; SR.Seed setting rate; BRR.Brown rice rate;MRY.Milled rice rate; HRY.Head rice yield; GL.Grain length; GW.Grain width;LWR.Length-width ratio; PGWC.Percentage of grain with chalkiness; DEC.Degree of endosperm chalkiness.

多基因聚合在水稻綜合性狀分子改良中具有無以比擬的優(yōu)勢(shì)。田大剛等[7]將Pi9和Xa23聚合導(dǎo)入雜交水稻恢復(fù)系閩恢3189、閩恢3229和閩恢6118，獲得兼抗稻瘟病和白葉枯病的水稻恢復(fù)系分子改良系。姜潔鋒[6]利用MAS將抗稻瘟病基因Pi2和抗白葉枯病基因Xa7、Xa21和Xa23滲入到3個(gè)優(yōu)良的水稻光溫敏核不育系C815S、廣占63-4S和華328S背景中，創(chuàng)建了一系列抗病性得到明顯改良的光溫敏核不育系新材料。肖武名等[18]通過MAS將Pi46與Xa23展開有效聚合，實(shí)現(xiàn)了創(chuàng)制雙抗水稻種質(zhì)的目的。本研究結(jié)果表明，廣譜白葉枯病抗性基因Xa23的導(dǎo)入明顯提高了水稻分子改良系的白葉枯病抗性，抗性鑒定結(jié)果都達(dá)到了抗級(jí)水平。而3個(gè)稻瘟病抗性基因Pi2、Pi46和Pita的同時(shí)聚合，使得改良株系表現(xiàn)出更強(qiáng)、更持久的抗病性。連同Wx和fgr基因，共6個(gè)功能基因的MAS聚合效果顯著，這些分子改良系有望升級(jí)原有親本，在生產(chǎn)中具有良好應(yīng)用前景。

對(duì)于早世代穩(wěn)定改良株系，利用恢復(fù)基因分子標(biāo)記輔助選擇恢復(fù)力性狀，結(jié)合田間鑒定配合力，可提高雜交組合選育效率，促進(jìn)育種進(jìn)程。目前，已通過本研究獲得一批BC1F6的綜合性狀優(yōu)良、穩(wěn)定的株系及其雜交組合。其中R-19862、R-21064、R-19913、R-20765和R-21056入選新雙抗和低直鏈淀粉含量的香型恢復(fù)系，展開大規(guī)模組配和育種利用。綜上可知，充分利用分子標(biāo)記輔助選擇，多基因聚合分子改良選育穩(wěn)定優(yōu)異株系，結(jié)合早世代田間觀察，同時(shí)開展多個(gè)性狀的鑒定評(píng)價(jià)和雜交組配，進(jìn)而可快速、準(zhǔn)確的選育出綜合性狀優(yōu)良的新的改良株系和雜交組合。

[1] 程式華.中國(guó)超級(jí)稻育種技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016(2)：205-206.

[2] Yu H，Xie W，Li J，et al.A whole-genome SNP array (RICE6K) for genomic breeding in rice[J].Plant Biotechnology Journal，2014，12(1)：28-37.

[3] 王建康，李慧慧，張學(xué)才，等.中國(guó)作物分子設(shè)計(jì)育種[J].作物學(xué)報(bào)，2011，37(2)：191-201.

[4] Zong G，Wang A，Wang L，et al.A pyramid breeding of eight grain-yield related quantitative trait loci based on marker-assistant and phenotype selection in rice (OryzasativaL.) [J].Journal of Genetics and Genomics，2012，39(7)：335-350.

[5] 李玉營(yíng)，李聲春，李曉方.分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻抗蟲抗病基因育種研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43(6)：119-126.

[6] 姜潔鋒.分子標(biāo)記輔助選擇培育抗稻瘟病和白葉枯病水稻光溫敏核不育系[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[7] 田大剛，陳在杰，陳子強(qiáng)，等.分子標(biāo)記輔助選育聚合抗稻瘟病基因和抗白葉枯病基因的水稻改良新恢復(fù)系[J].分子植物育種，2014，12(5)：843-852.

[8] 李錦江，肖友倫，孟秋成，等.水稻抗稻瘟病和抗白葉枯病基因聚合品系抗性分析[J].雜交水稻，2012(5)：59-66.

[9] 王 軍，楊 杰，陳志德，等.利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻抗病基因Pi-ta、Pi-b和Stv-bi[J].作物學(xué)報(bào)，2011，37(6)：975-981.

[10] 張分云，李 宏，周向陽，等.水稻產(chǎn)量分子設(shè)計(jì)育種研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2013，11(6)：663-672.

[11] 孫大元，周丹華，肖武名，等.利用MAS技術(shù)培育高抗稻瘟病的雜交水稻恢復(fù)系航恢1173[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，29(6)：121-125.

[12] 周黎軍，王 麗，魏 琴，等.利用水稻早世代穩(wěn)定特性選育雜交水稻恢復(fù)系[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2007，21(3)：265-269.

[13] 陳深廣，周屹峰，趙 霏，等.利用Wx和fgr基因雙功能性標(biāo)記高效選育優(yōu)質(zhì)水稻保持系[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2011，25(1)：31-36.

[14] Phing Lau W C，Latif M A，Y Rafii M，et al.Advances to improve the eating and cooking qualities of rice by marker-assisted breeding[J].Critical Reviews in Biotechnology，2016，36(1)：87-98.

[15] Luo W L，Guo T，Yang Q Y，et al.Stacking of five favorable alleles for amylase content，fragrance and disease resistance into elite lines in rice (Oryzasativa) by using four HRM-based markers and a linked gel-based marker[J].Molecular Breeding，2014，34(3)：805-815.

[16] 倪大虎.利用分子標(biāo)記輔助選擇改良水稻對(duì)白葉枯病和稻瘟病抗性的研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[17] 鄧其明，周 鵬，林 琳，等.水稻稻瘟病抗性基因研究進(jìn)展及其在育種上的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(4)：1489-1492.

[18] 肖武名，孫大元，王 慧，等.分子標(biāo)記選育稻瘟病和白葉枯病雙抗種質(zhì)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，29(1)：203-207.

[19] 楊勤忠，林 菲，馮淑杰，等.水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(5)：1601-1615.

[20] Jin L，Lu Y，Shao Y，et al.Molecular marker assisted selection for improvement of the eating，cooking and sensory quality of rice(OryzasativaL.) [J].Journal of Cereal Science，2010，51(1)：159-164.

[21] Chen L K，Gao W W，Guo T，et al.A genotyping platform assembled with high-throughput DNA extraction，codominant functional markers，and automated CE system to accelerate marker-assisted improvement of rice[J].Molecular Breeding，2016，36(9)：1-12.

[22] Concepcion J C，Ouk M，Zhao D A.The need for new tools and investment to improve the accuracy of selecting for grain quality in rice[J].Field Crops Research，2015，182(SI)：60-67.

[23] Spindel J，Wright M，Chen C，et al.Bridging the genotyping gap：using genotyping by sequencing (GBS) to add high-density SNP markers and new value to traditional bi-parental mapping and breeding populations[J].Theoretical and Applied Genetics，2013，126(11)：2699-2716.

[24] Hirano H Y，Eiguchi M，Sano Y.A single base change altered the regulation of the waxy gene at the posttranscriptional level during the domestication of rice[J].Molecular Biology and Evolution，1998，15(8)：978-987.

[25] Bradbury L M，F(xiàn)itzgerald T L，Henry R J，et al.The gene for fragrance in rice[J].Plant Biotechnology Journal，2005，3(3)：363-370.

[26] 王春連，戚華雄，潘海軍，等.水稻抗白葉枯病基因Xa23的EST標(biāo)記及其在分子育種上的利用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(10)：1996-2001.

[27] Wang C，F(xiàn)an Y，Zheng C，et al.High-resolution genetic mapping of rice bacterial blight resistance geneXa23[J].Molecular Genetics and Genomics，2014，289(5)：745-753.

Molecular Improvement Based on the Strategy of ′Multiple Genes Pyramiding-early-generation Hybridized Combination′ in Rice

CHEN Likai，GUO Tao，LIU Yongzhu，WANG Hui，CHEN Zhiqiang

(National Engineering Research Centre of Plant Space Breeding，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Low selection-efficient and long cycle are the main bottle necks of conventional breeding technique.In order to make improvement of the efficiency of variety breeding and hybridized-combination，we innovated the molecular breeding strategy in rice.Then we carried out molecular improvement of restorer line and evaluation of new hybrid combination by multiple genes pyramiding and early-generation hybridized combination.The donor parent H318 was hybridized with restorer parent Huazhan，and we constructed the multiple genes pyramiding technology by selection and design molecular markers，and performed pyramiding-improvement application with 6 functional genes for grain quality，fragrance，and disease resistance，includingWxb，fgr，Xa23，Pi2，Pi46，andPita.As the result，we achieved a series of 14 stable rice lines with genetic background of restorer line Huazhan，homozygous target-genes，and high grain-quality，double-resistant，and fragrance.In accordance with stable-inheritance properties，ideas of early-generation hybridized combination was raised.Test cross of improved lines with CMS lines in production practice of NingA and C815S were carried out，and performance of new hybrid combination was evaluated，therefore，potential superior hybrid rice was screened and achieved.In this study，breeding programs adopted the strategy of multiple genes pyramiding-early-generation hybridized combination，this method could realize the quick pyramiding of multiple favorable genes，targeted improvement of key traits of grain quality and disease-resistant，promotion of high-efficiency breeding of hybrid rice.

Rice； Molecular improvement； Genes pyramiding； Hybridized combination； Restorer line

2017-04-21

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”項(xiàng)目(2016YFD0102102)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015B02031011)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-01-12)

陳立凱(1986-)，男，廣東汕頭人，博士，主要從事植物遺傳和分子生物學(xué)研究。

陳志強(qiáng)(1956-)，男，廣東揭陽人，教授，碩士，主要從事水稻遺傳育種相關(guān)研究。 郭 濤(1978-)，男，河南駐馬店人，教授，博士，主要從事水稻遺傳育種相關(guān)研究。

S435.1；S511.03

A

1000-7091(2017)03-0077-08

10.7668/hbnxb.2017.03.012