三重qPCR法快速檢測(cè)肺炎克雷伯菌的方法建立與應(yīng)用

鄒享珍，蔡淑英，劉妙娥，林丹麗，桑 慧

(東莞樟木頭醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 東莞523633)

三重qPCR法快速檢測(cè)肺炎克雷伯菌的方法建立與應(yīng)用

鄒享珍，蔡淑英，劉妙娥，林丹麗，桑 慧

(東莞樟木頭醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 東莞523633)

目的 建立三重qPCR法(實(shí)時(shí)熒光定量)快速檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA基因，期以快速精準(zhǔn)診斷呼吸道肺炎克雷伯氏菌感染，為早期精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。方法 根據(jù)GenBank公布的肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA基因序列選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)測(cè)序引物，高保真擴(kuò)增東莞樟木頭醫(yī)院分離到的95株肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA 基因，經(jīng)測(cè)序比對(duì)后，避開變異區(qū)和突變點(diǎn)分別設(shè)計(jì)檢測(cè)引物和探針，建立三重qPCR方法直接檢測(cè)臨床呼吸道樣本，并與培養(yǎng)及測(cè)序法比較，驗(yàn)證其診斷靈敏度和特異性等性能指標(biāo)。結(jié)果 三重qPCR法檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA基因，其檢測(cè)下限低至2 cfu/PCR，檢測(cè)靈敏度98.9%(94/95),檢測(cè)特異性97.9%(93/95)；診斷靈敏度98.6%(424/430)，診斷特異性98.8%(2295/2324)；從樣品處理到報(bào)告結(jié)果≤1.2 h。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性好，可實(shí)現(xiàn)呼吸道肺炎克雷伯氏菌感染的快速與精準(zhǔn)診斷，為早期精準(zhǔn)治療贏得時(shí)間。

肺炎克雷伯氏菌；精準(zhǔn)診斷；qPCR；rcsA基因；23s RNA基因

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的病原菌之一，可引起較嚴(yán)重的下呼吸道感染甚至死亡，其臨床癥狀與其他細(xì)菌感染并無兩樣，臨床難以針對(duì)該菌精準(zhǔn)治療。近年來，由于無法早期精準(zhǔn)治療，其耐藥問題日益突出，嚴(yán)重影響了治療效果[1，2]。培養(yǎng)法是目前常用的檢測(cè)方法，也是金標(biāo)準(zhǔn)，一般需要2-3天，甚至更久，其時(shí)效性、簡(jiǎn)便性、靈敏度等均無法滿足臨床快速精準(zhǔn)診斷的需求[3]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)以其快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在病原微生物基因快速檢測(cè)方面迅速發(fā)展，已成為金標(biāo)準(zhǔn)方法的重要補(bǔ)充[4-6]，比如，國(guó)內(nèi)已公布兩項(xiàng)專利應(yīng)用于肺炎克雷伯菌的輔助診斷[7，8]。但筆者發(fā)現(xiàn)，兩項(xiàng)專利技術(shù)只檢測(cè)單基因，且均未對(duì)我國(guó)流行分布的肺炎克雷伯菌相關(guān)基因進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，僅根據(jù)NCBI或文獻(xiàn)資料來設(shè)計(jì)引物和探針，由于生物進(jìn)化、地區(qū)分布不同等原因，可能存在靈敏度不夠或特異性不強(qiáng)的致命缺點(diǎn)。在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)日益發(fā)展的當(dāng)下，現(xiàn)有發(fā)明已無法滿足需求，發(fā)明新的能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷并適合我國(guó)人群的方法迫在眉前。由此，筆者基于Taqman 熒光探針技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)肺炎克雷伯菌rcsA和23s RNA兩個(gè)持家基因，在進(jìn)一步提高檢測(cè)和診斷靈敏度、特異性方面取得了較好效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 留取2015年1月 -2016年12月期間來東莞樟木頭醫(yī)院就診的呼吸道感染患者下呼吸道樣本2754例，其中，男性1051例，女性1703例，年齡0.7-85歲。

1.1.2 儀器與試劑 ①細(xì)菌培養(yǎng)基產(chǎn)自江門凱林公司，類型：血平板、麥康凱平板和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂；細(xì)菌鑒定藥敏分析儀產(chǎn)自英國(guó)SENSITITRE公司，型號(hào)：AutoReader；細(xì)菌鑒定卡為原配細(xì)菌鑒定卡。②核酸提取儀產(chǎn)自深圳市匯研科創(chuàng)公司，型號(hào)：ExPure-20；提取試劑為配套的磁珠法呼吸道樣本核酸提取及細(xì)菌培養(yǎng)物核酸提取試劑盒。③熒光定量PCR儀產(chǎn)自Roche公司，型號(hào)：LightCycler480及上海宏石公司出產(chǎn)的SLAN-965；多重?zé)晒舛縋CR 體系(5*qPCR MIX)購自上海靈鈺生物技術(shù)公司；高保真體系(Super-Fidelity DNA Polymerase)購自Vazyme公司；EvaGreen熒光染料購自美國(guó)Biotium公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和選取 痰液樣本采用吸痰或深咳法留取于無菌痰培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，經(jīng)涂片革蘭氏染色鏡檢，白細(xì)胞 >25個(gè)/HP ，鱗狀上皮細(xì)胞<10個(gè)/HP判為合格，否則棄用；肺泡灌冼液直接注入無菌痰培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定 將合格的痰液或肺泡灌冼液接種于血平板和康凱平板，置35℃ CO2孵箱培養(yǎng)24-48小時(shí)，挑取可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、氧化酶和觸酶試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇相應(yīng)的細(xì)菌鑒定卡上機(jī)鑒定。所有操作按儀器和試劑SOP 文件進(jìn)行。

1.2.3 核酸提取與純化 ① 痰液細(xì)菌基因組核酸提?。涸谔狄菏占恐屑s加入等體積痰液液化劑(含N-乙酰-L-半胱氨酸1.0%，乳化劑0.25%，滅菌劑0.2%，EDTA 10 mmol/L)，漩渦振蕩5 min，吸取液化痰液100 μl 至上述磁珠法呼吸道樣本核酸提取試劑條第一孔，上機(jī)提取細(xì)菌基因組核酸。② 肺泡灌冼液細(xì)菌基因組核酸提?。褐苯尤〖?xì)胞灌冼液100 μl同痰液細(xì)菌基因組核酸提取方法上機(jī)提取。③ 細(xì)菌培養(yǎng)物基因組核酸提?。禾羧〖兣囵B(yǎng)菌落用生理鹽水調(diào)成0.5 Mcf 菌懸液，吸菌懸液100 μl至上述磁珠法細(xì)菌培養(yǎng)物核酸提取試劑條第一孔，上機(jī)提取細(xì)菌基因組核酸。所有操作按儀器和試劑SOP 文件進(jìn)行，提取純化后的核酸吸入無酶EP管凍存于-86℃冰箱備用。

1.2.4 質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建 用DNAMN 軟件生成一段1 000 bp 隨機(jī)DNA序列，其中A、T、C、G 四種堿基各占25%，委托TaKaRa大連寶生物公司構(gòu)建和提取質(zhì)粒。

1.2.5 測(cè)序引物設(shè)計(jì)與合成 從GenBank數(shù)據(jù)庫下載肺炎克雷伯氏菌rcsA和23S rRNA基因序列各50條，用DNAMN比對(duì)軟件分別進(jìn)行比對(duì)，避開變異區(qū)或突變點(diǎn)后，用Primer 5 設(shè)計(jì)rcsA、23S rRNA基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒測(cè)序引物各3對(duì)，委托TaKaRa大連寶生物公司合成。

1.2.6 高保真體系、擴(kuò)增參數(shù)優(yōu)化 ①rcsA和23S rRNA基因測(cè)序引物篩選與擴(kuò)增參數(shù)優(yōu)化：挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺炎克雷伯氏菌純培養(yǎng)菌落用生理鹽水調(diào)成約2.0*108cfu/ml，經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)法確定濃度后稀釋至1.0*108cfu/ml，10倍連續(xù)稀釋成8個(gè)梯度濃度菌懸液，提取純化核酸后，在高保真PCR體系中加入推薦濃度的引物、模板和EvaGreen熒光染料，用三步擴(kuò)增加溶點(diǎn)曲線方法在不同退火溫度條件下擴(kuò)增梯度濃度模板，分別從3對(duì)測(cè)序引物中選一對(duì)擴(kuò)增效率、線性范圍與關(guān)系、非特異擴(kuò)增、熒光值增幅及擴(kuò)增曲線形狀最均衡的引物作為最終測(cè)序引物，以該引物的最佳擴(kuò)增參數(shù)作為最終的擴(kuò)增參數(shù)。② 質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒測(cè)序引物篩選與擴(kuò)增參數(shù)優(yōu)化：根據(jù)質(zhì)粒濃度用計(jì)算法將質(zhì)粒稀釋至1.0*108Copies/ml ，再10倍連續(xù)稀釋成8個(gè)梯度濃度，同方法①一樣選出一對(duì)最好的引物并確定擴(kuò)增參數(shù)。

1.2.7 高保真PCR產(chǎn)物測(cè)序與質(zhì)控 用優(yōu)化后的高保真體系和溫度參數(shù)擴(kuò)增95株臨床分離的肺炎克雷伯氏菌rcsA和23S rRNA基因，同時(shí)擴(kuò)增質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒，高保真PCR產(chǎn)物委托廣東騰飛基因公司測(cè)序，質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列100%符合方接受臨床分離株測(cè)序結(jié)果。

1.2.8 三重qPCR引物、探針設(shè)計(jì)與合成標(biāo)記 根據(jù)測(cè)序分析比對(duì)結(jié)果，避開變異區(qū)或突變點(diǎn)后，用Beacon Designer 7 設(shè)計(jì)肺炎克雷伯菌rcsA和23S rRNA基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒檢測(cè)引物和探針各3組，委托TaKaRa大連寶生物公司合成及標(biāo)記。

1.2.9 三重qPCR體系、擴(kuò)增參數(shù)優(yōu)化 采用交叉組合方式，在多重?zé)晒舛縋CR 體系中加入推薦濃度的引物、探針、和上述1.2.6的梯度濃度模板及適量質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)，用兩步法在不同退火溫度條件下擴(kuò)增，分別從9組檢驗(yàn)引物、探針中選一組擴(kuò)增效率、線性范圍與關(guān)系、非特異擴(kuò)增、熒光值增幅及擴(kuò)增曲線形狀最均衡的作為最終檢測(cè)體系，以該體系的最佳擴(kuò)增參數(shù)作為最終的擴(kuò)增參數(shù)。

1.2.10 三重qPCR結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) rcsA和23S rRNA兩基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增曲線均呈“S”形，CT值均≤36，擴(kuò)增曲線與基線夾角均≥30°判為陽性，否則判為陰性。1.2.11 三重qPCR檢測(cè)下限試驗(yàn)與判斷 用優(yōu)化的三重qPCR檢測(cè)體系和參數(shù)擴(kuò)增1.2.6的梯度濃度模板，以能判陽的最低加入模板數(shù)作為檢測(cè)下限。

1.2.12 三重qPCR檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)與計(jì)算 用優(yōu)化的三重qPCR檢測(cè)體系和參數(shù)擴(kuò)增95株肺炎克雷伯菌，計(jì)算檢測(cè)靈敏度。檢測(cè)靈敏度=陽性數(shù)÷95*100%。

1.2.13 三重qPCR檢測(cè)特異性試驗(yàn) 用優(yōu)化的三重qPCR檢測(cè)體系和參數(shù)擴(kuò)增95株非肺炎克雷伯菌的其他呼吸道常見感染菌(包括：金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、β溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌各10株及卡他莫拉菌5株)，計(jì)算檢測(cè)特異性。檢測(cè)特異性=陰性數(shù)÷95*100%。

1.2.14 三重qPCR真陽性、真陰性判斷與驗(yàn)證 真陽性：①培養(yǎng)鑒定為肺炎克雷伯菌；②培養(yǎng)法陰性，但qPCR法陽性，經(jīng)高保真擴(kuò)增測(cè)序與肺炎克雷伯菌ATCC 700603標(biāo)株兩基因的相同片段同源性≥90%。真陰性：①培養(yǎng)及qPCR兩種檢測(cè)方法均為陰性；② qPCR檢測(cè)陽性，但經(jīng)高保真擴(kuò)增測(cè)序與標(biāo)株相同片段同源性<90%。

1.2.15 三重qPCR診斷靈敏度、特異性試驗(yàn)與計(jì)算 將合格的臨床呼吸道樣本用三重qPCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與培養(yǎng)法不一致時(shí)，按1.2.14方式處理和判斷。診斷靈敏度=真陽性數(shù)÷(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))*100%；診斷特異性=真陰性數(shù)÷(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))*100%。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定結(jié)果 2015年1月-2016年12月期間，共收到合格呼吸道樣本2754份，分離出355株肺炎克雷伯菌及金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌等其他細(xì)菌881株。

2.2 測(cè)序引物篩選結(jié)果 9對(duì)測(cè)序引物經(jīng)篩選后，綜合性能最好的3對(duì)引物序列見表1。

2.3 高保真體系優(yōu)化結(jié)果 高保真PCR反應(yīng)體系為25.0 μl，包括2*Buffer 12.5 μl、dNTP MIX(10 mM each)0.5 μl、10 μM引物各0.5 μl、53倍高保真熱啟動(dòng)DNA聚合酶(1 U/μl)0.5 μl、50*EvaGreen 0.5 μl、模板5.0 μl，加無菌雙蒸水至終體積25.0 μl。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：95℃ 2 min+(95℃ 10 s，59℃ 10 s，72℃ 30 s)*30，選擇FAM通道于延伸階段探測(cè)熒光。用該體系擴(kuò)增肺炎克雷伯菌模板，擴(kuò)增曲線呈“S”形，與基線夾角≥45°；水空白曲線與基線平行，無非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，擴(kuò)增曲線見圖1。

2.4 三重qPCR引物、探針物篩選結(jié)果 9組檢測(cè)引物、探針經(jīng)篩選后，綜合性能最好的3組引物、探針序列見表2。

表2 rcsA和23S rRNA基因及質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)三重qPCR引物、探針表

2.5 三重qPCR體系、擴(kuò)增參數(shù)優(yōu)化結(jié)果 三重qPCR反應(yīng)體系為40.0 μL，包括5*qPCR MIX 8.0 μl、10 μM引物各1.2 μL、10 μM探針各0.4 μL、50 Copies/ul質(zhì)控/內(nèi)標(biāo)0.1 μL，模板20.0 μL，加無菌雙蒸水至終體積40.0 μL。qPCR擴(kuò)增參數(shù)為：95℃ 2分鐘+(95℃ 10秒，60℃ 40秒)*40，選擇FAM、VIC和ROX 三通道于退火階段探測(cè)熒光。用該體系擴(kuò)增48份呼吸道樣本模板，擴(kuò)增曲線呈“S”形，與基線夾角≥45°；水空白曲線與基線平行，無起跳。FAM通道擴(kuò)增曲線見圖2。

2.6 三重qPCR檢測(cè)下限試驗(yàn)結(jié)果 三重qPCR檢測(cè)體系擴(kuò)增肺炎克雷伯菌梯度濃度模板，擴(kuò)增曲線呈“S”形，各梯度間隔均勻，最低檢測(cè)濃度為102cfu/ml，對(duì)應(yīng)的最低檢測(cè)限為2 cfu/PCR，水空白曲線與基線平行，無起跳。FAM通道擴(kuò)增曲線見圖3。

圖3 三重qPCR擴(kuò)增肺炎克雷伯梯度模板熒光曲線圖

2.7 三重qPCR檢測(cè)靈敏度及特異性試驗(yàn)結(jié)果 三重qPCR檢測(cè)體系擴(kuò)增95株肺炎克雷伯菌，94株陽性，檢驗(yàn)靈敏度98.9%(94/95)；擴(kuò)增95株非肺炎克雷伯菌模板，2株陽性，檢驗(yàn)特異性97.9%(93/95)。

2.8 三重qPCR診斷靈敏度及特異性試驗(yàn)結(jié)果 三重qPCR檢測(cè)體系擴(kuò)增2754份呼吸道樣本模板，從培養(yǎng)肺炎克雷伯菌陽性的355份樣本中，檢出349份陽性，6份陰性；從未培養(yǎng)出肺炎克雷伯菌的2399份樣本中，檢出104份陽性，這 104份樣本經(jīng)高保真擴(kuò)增測(cè)序后比對(duì)后，有75份為肺炎克雷伯菌，29份為非肺炎克雷伯菌。經(jīng)計(jì)算，三重qPCR診斷靈敏度為98.6%(424/430)，特異性為98.8%(2295/2324)。

3 討論

近年來，隨著抗生素、免疫抑制劑、激素的大量使用，肺炎克雷伯菌感染呈上升趨勢(shì)，除可引起下呼吸道感染外，還可引發(fā)菌血癥、膿毒癥、肝膿腫及泌尿系感染[9]。目前，肺炎克雷伯菌的檢測(cè)以痰培養(yǎng)技術(shù)為金標(biāo)準(zhǔn)，該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作繁瑣。二十世紀(jì)末，Higuchi等[10]人發(fā)明了實(shí)時(shí)熒光Taqman探針定量PCR技術(shù)，將PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)合一起進(jìn)行定量分析。而三重qPCR檢測(cè)方法的原理，是在實(shí)時(shí)熒光Taqman探針定量的基礎(chǔ)上，采用多孔板，利用熒光染料和探針，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品或者基因，針對(duì)不同基因設(shè)計(jì)具有相同或接近的退火溫度和延伸時(shí)間的引物和探針的分析技術(shù)。因反應(yīng)體積少，還大大的節(jié)省試劑和時(shí)間，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)快速等特點(diǎn)，所以比細(xì)菌培養(yǎng)方法靈敏快速。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光Taqman探針技術(shù)也只應(yīng)用于肺炎克雷伯菌的RNA基因的單個(gè)檢測(cè)，均未對(duì)我國(guó)流行分布的肺炎克雷伯菌相關(guān)基因進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，僅根據(jù)NCBI或文獻(xiàn)資料來設(shè)計(jì)引物和探針，由于生物進(jìn)化、地區(qū)分布不同等原因，可能存在靈敏度不夠或特異性不強(qiáng)的致命缺點(diǎn)。本文選取肺炎克雷伯菌的rcsA和23s RNA兩個(gè)持家基因來設(shè)計(jì)引物和探針，在實(shí)時(shí)熒光Taqman探針技術(shù)的基礎(chǔ)上，經(jīng)測(cè)序比對(duì)后，避開變異區(qū)和突變點(diǎn)分別設(shè)計(jì)檢測(cè)引物和探針，建立三重qPCR方法直接檢測(cè)臨床呼吸道樣本，周時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品和基因。并與培養(yǎng)及測(cè)序法比較，驗(yàn)證其診斷靈敏度和特異性等性能指標(biāo)。研究表明，三重qPCR檢測(cè)體系經(jīng)優(yōu)化后檢測(cè)靈敏度及特異性高為98.9%、97.9%；診斷靈敏度及特異性高為98.6%、98.8%。具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，并在從樣品處理到報(bào)告結(jié)果≤1.2 h極短時(shí)間內(nèi)做出快速診斷，為臨床醫(yī)生的抗生素治療方案提供快速有效的科學(xué)依據(jù)，完全可用于下呼吸道感染的初步篩選和指導(dǎo)臨床抗生素的合理使用，有效預(yù)防多重耐藥菌的產(chǎn)生和傳播。同時(shí)為本實(shí)驗(yàn)室將建立一種同時(shí)檢測(cè)多個(gè)細(xì)菌實(shí)施三重?zé)晒舛?PCR方法，形成一套多通道快速檢測(cè)兒童重癥呼吸道感染病原體的方法提供了參考。

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