嬰幼兒肝炎綜合征患者代謝因子臨床意義研究

李 嫻，宋銀森，趙 鼎，李林飛，張振華，陳重芬，郭振欣

(鄭州市兒童醫(yī)院,河南 鄭州450000)

嬰幼兒肝炎綜合征患者代謝因子臨床意義研究

李 嫻，宋銀森，趙 鼎，李林飛，張振華，陳重芬，郭振欣*

(鄭州市兒童醫(yī)院,河南 鄭州450000)

目的 探討嬰幼兒肝炎綜合征(IHS)患兒干血片氨基酸和肉堿濃度變化的臨床意義。方法 應(yīng)用HPLC/MS/MS測(cè)定患兒組與對(duì)照組干血片氨基酸及肉堿濃度。結(jié)果 患兒組與對(duì)照組相比辛?；鈮AC8、葵?；鈮AC10濃度降低，十四烷酰基肉堿C14、十六烷?；鈮AC16濃度升高(P<0.05)；纈氨酸(VAL)濃度降低，瓜氨酸(CIT)濃度升高(P<0.05)。結(jié)論 嬰幼兒肝炎綜合征患兒血中氨基酸及肉堿濃度的變化對(duì)其診斷和治療具有一定的臨床意義。

氨基酸;肉堿;嬰兒肝炎綜合征;串聯(lián)質(zhì)譜法

(ChinJLabDiagn,2017,21:0990)

嬰幼兒肝炎綜合征簡(jiǎn)稱嬰肝征(IHS)，它不是一種獨(dú)立的疾病，而是指一組1歲以內(nèi)(包括新生兒期)起病，伴有血清膽紅素升高，肝臟腫大和肝功能損害的臨床癥候群。它是嬰幼兒期常見的黃疸性疾病之一，以肝內(nèi)病變?yōu)橹鳎∫驈?fù)雜、預(yù)后懸殊。為探討遺傳代謝病篩查在嬰幼兒肝炎綜合征診治中的價(jià)值，我們應(yīng)用HPLCC/MS/MS技術(shù)對(duì)100例嬰幼兒肝炎綜合征患兒及同期在我院體檢的100例健康兒童測(cè)定其干血片中氨基酸和肉堿的濃度，其結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2013年10月-2014年11月我院消化內(nèi)科住院治療的嬰幼兒肝炎綜合征患兒共100例，其中年齡最小為1個(gè)月，最大為2歲，男57例，女43例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考全國(guó)嬰幼兒肝炎綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。對(duì)照組為同期在我院健康體檢的兒童100例，男60例，女40例，年齡6個(gè)月-3歲。兩組在年齡、性別分布上無顯著差異(P>0.05)。

1.2 標(biāo)本采集方法 使用一次性采血針刺足跟或手指，深度小于3 mm，將血滴于Scheicher and Schuell 903濾紙樣本卡，血斑正反面一致，室溫下自然晾干呈深褐色，放于封口塑料袋內(nèi)，保存于2-8℃冰箱中待檢。

1.3 儀器及試劑 甲醇、乙腈、甲酸胺、甲酸均為高效液相色譜級(jí)別，購(gòu)自Sigma公司。96孔聚丙烯錐形板，96孔過濾板，同位素內(nèi)標(biāo)及質(zhì)控購(gòu)自PerkinElmer公司。氨基酸內(nèi)標(biāo)11種：2H4-丙氨酸，2H4，13C-精氨酸，2H2-瓜氨酸，15N，2-13C-甘氨酸，2H3-亮氨酸，2H3-蛋氨酸，2H6-鳥氨酸，13C6-苯丙氨酸，13C5-脯氨酸，13C6-酪氨酸，2H8-纈氨酸。?；鈮A內(nèi)標(biāo)13種：2H9-游離肉堿，2H3-乙酰肉堿，2H3-丙酰肉堿，2H3-丁酰肉堿，2H9-異戊酰肉堿，2H6-戊二酰肉堿，2H3-己酰肉堿，2H3-辛酰肉堿，2H3-癸酰肉堿，2H3-十二酰肉堿，2H3-十四酰肉堿，2H3-十六酰肉堿，2H3-十八酰肉堿。上述內(nèi)標(biāo)在實(shí)驗(yàn)前用甲醇稀釋成工作液備用。儀器:美國(guó)安捷侖公司高效液相色譜儀(Agilent 1600) 及6460Triple Quad MS/MS型串聯(lián)質(zhì)譜儀。

1.4 測(cè)定方法 用打孔器將濾紙片打出直徑3 mm的圓形濾紙血片，置于96孔過濾板中，每次實(shí)驗(yàn)加入高低兩個(gè)質(zhì)控及一個(gè)空白，每孔加入工作液100 μl，以封板膜密封，放置于恒溫震蕩儀以700轉(zhuǎn)/分震蕩45 min，然后提取75 μl上清液加入另一個(gè)96孔聚丙烯錐形板中，鋁箔包裹，即上樣檢測(cè)。高效液相色譜儀的流動(dòng)相采用乙腈和純水，自動(dòng)進(jìn)樣器每次進(jìn)樣2 μl，每次測(cè)定采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)。一個(gè)樣品測(cè)試約需7 min。

1.5 數(shù)據(jù)分析 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的定量分析采用安捷倫公司的自帶軟件Mass Hunter B.05.00 根據(jù)各種氨基酸、肉堿及其同位素內(nèi)標(biāo)的離子峰強(qiáng)度計(jì)算出樣品中氨基酸及肉堿濃度，采用spss 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測(cè)定結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。IHS組患兒與正常組的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

IHS組與對(duì)照組相比，辛酰基肉堿C8、葵酰基肉堿C10濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；十四烷?；鈮AC14、十六烷?；鈮AC16濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其它肉堿與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HIS組與對(duì)照組比較，纈氨酸(VAL)濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；瓜氨酸(CIT)濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其它氨基酸與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1，表2。

表1 嬰肝組與對(duì)照組血片的肉堿濃度比較

3 討論

采用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行新生兒及嬰幼兒的遺傳代謝病篩查已經(jīng)廣泛應(yīng)用于美國(guó)、歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家[2,3]。嬰幼兒肝炎綜合征患兒體內(nèi)存在代謝紊亂，董梅[4]對(duì)遺傳代謝病類嬰幼兒肝炎綜合征進(jìn)行分類，分為四類，分別是膽汁酸代謝障礙，糖代謝障礙，氨基酸代謝障礙及脂類代謝障礙。我們使用HPLC/MS/MS對(duì)100例嬰幼兒肝炎綜合征患兒進(jìn)行遺傳代謝病篩查發(fā)現(xiàn)部分氨基酸及肉堿濃度發(fā)生改變，如：辛?；鈮AC8、葵?；鈮AC10、十四烷?；鈮AC14、十六烷?；鈮AC16、纈氨酸、瓜氨酸。說明這些物質(zhì)可能與嬰幼兒肝炎綜合征有密切關(guān)系。患兒血片中辛?；鈮AC8、葵?；鈮AC10濃度升高提示可能患有中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥(MCAD)。而我們的研究發(fā)現(xiàn)嬰幼兒肝炎綜合征患兒血片中辛?；鈮AC8及葵酰基肉堿C10濃度明顯降低，提示嬰幼兒肝炎綜合征患兒體內(nèi)存在脂肪酸代謝障礙，與中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥(MCAD)能明顯區(qū)分開來。患兒血片中十四烷?；鈮AC14及十六烷酰基肉堿C16濃度升高提示可能存在極長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥(VLCAD),我們的研究發(fā)現(xiàn)嬰幼兒肝炎綜合征患兒體內(nèi)C14及C16濃度較對(duì)照組升高，但在正常參考范圍上限以內(nèi)；嬰幼兒肝炎綜合征與VLCAD不容易區(qū)分，因此實(shí)踐中我們要結(jié)合基因診斷、酶學(xué)分析及脂肪酸氧化流量分析等綜合考慮[5,6]。

表2 嬰肝組與對(duì)照組血片的氨基酸濃度比較

嬰幼兒肝炎綜合征患兒體內(nèi)也存在氨基酸代謝紊亂。瓜氨酸是尿素循環(huán)中的中間代謝產(chǎn)物，當(dāng)尿素循環(huán)受阻時(shí)就會(huì)導(dǎo)致瓜氨酸在體內(nèi)貯積、血氨升高，嬰幼兒肝炎綜合征常伴有肝功能損害，我們推測(cè)可能是這個(gè)原因引起瓜氨酸濃度升高、血氨升高。纈氨酸是人體八種必需氨基酸之一，它與亮氨酸及異亮氨酸一起工作，促進(jìn)身體正常生長(zhǎng)，它還幫助從肝臟清除多余的氮，并將身體需要的氮運(yùn)輸?shù)礁鱾€(gè)部位，當(dāng)嬰肝癥發(fā)生時(shí)，纈氨酸與對(duì)照組相比濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而亮氨酸雖然濃度也降低，但是與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此對(duì)嬰幼兒肝炎綜合征來說，纈氨酸可能更敏感一些，作為一個(gè)輔助指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療。

嬰幼兒肝炎綜合征病因很多，常見以感染為主，病毒感染是其主要病因，大約占50%[7]。嬰幼兒肝炎綜合征并發(fā)癥多，預(yù)后各不相同，因此需要聯(lián)合檢測(cè)生化、B超等多種指標(biāo)以明確病因?qū)ΠY治療[8,9]，降低患兒死亡率。

[1]朱啟镕，王曉紅，王建設(shè).嬰兒肝病綜合征診治修訂方案[J].中華傳染病雜志，2004，22(5)：357.

[2]Therrell BL,Adams J.New born screening in North American[J].J Inherit Metab Dis,2007,30(4):447.

[3]Loeber JG.Neonatal screening in Europe:the situation in2004[J].J Inherit Metab Dis,2007,30(4)：430.

[4]董 梅.遺傳代謝病類嬰兒肝炎綜合征[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2011，26(7)：469.

[5]Liebig M,Schymik I,Mueller M,et al.Neonatal screening for very long-chain acyl-coA dehydrogenase deficiency:enzymatic and molecular evaluation of neonates with elevated C14:1-carnitine levels[J].Pediatrics,2006,118(3):1065.

[6]Wanders RJ,Vreken P,den Boer ME,et al.Disorders of mitochondrial fatty acyl-CoA beta-oxidation[J].J Inherit Metab Dis,1999,22(4):442.

[7]宋文琪，張美和,等.血清總膽汁酸測(cè)定在嬰兒肝炎綜合征中的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2001，24：227.

[8]丁 艷，熊 昊，黃志華,等.嬰兒肝炎綜合征血清和膽汁成分變化的臨床意義[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2007，22(7)：506.

[9]卜勁松.生化指標(biāo)變化對(duì)嬰兒炎肝綜合征的臨床診斷價(jià)值[J].中國(guó)婦幼保健，2012，33：5434.

The Clinical Significance of metabolic factor in infant hepatitis syndrome

LIXian,SONGYin-sen,ZHAODing,etal.

(ZhengzhouChildren'sHospital，Zhengzhou450000,China)

Objective The clinical significance of amino acid and carnitine with dried blood concentration in children of infantile hepatitis syndrome (IHS).Methods HPLC/MS/MS was used to examine the dried blood samples of infantile hepatitis syndrome (IHS) with the control group and the patient group of amino acid and carnitine concentration. Results Compared with control group,octanoylcarnitine C8,decanoylcarnitine C10 concentration is reduced,while tetradecyl acyl carnitine C14,palmitoylcarnitine C16 concentration increases(P< 0.05); Valine (VAL) concentration is reduced,citrulline (CIT) concentration increases(P<0.05) .Conclusion Changes in amino acid and carnitine concentrations in blood of children with hepatitis syndrome in infants conclusion has some clinical significance in the diagnosis and treatment.

Amino acid；Carnitine；Infant hepatitis syndrome；Tandem mass spectrometry

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)201304082

*通訊作者

1007-4287(2017)06-0990-03

R725

A

李嫻，女，34歲，碩士，主管檢驗(yàn)技師，研究方向：小兒遺傳及代謝病。

2016-11-12)