P16和SOX2蛋白在子宮頸活檢上皮內(nèi)瘤變中的診斷意義

桂華偉,王緒明,黃利華,黃 萱,陳瓊霞,劉麗江*

(1.武漢市普愛醫(yī)院 病理科，湖北 武漢430056;2.江漢大學(xué)江大病理診斷所組織病理部)

P16和SOX2蛋白在子宮頸活檢上皮內(nèi)瘤變中的診斷意義

桂華偉1,王緒明2,黃利華1,黃 萱2,陳瓊霞2,劉麗江2*

(1.武漢市普愛醫(yī)院 病理科，湖北 武漢430056;2.江漢大學(xué)江大病理診斷所組織病理部)

目的 研究P16、P53、SOX2及Ki-67在子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)病變中的表達(dá)及臨床價值分析。方法 收集子宮頸活檢病例92例，用免疫組化染色檢查P16、P53、SOX2及Ki-67在子宮頸CIN病變表達(dá)中的表達(dá)情況，分析其與CIN分級的相關(guān)性。結(jié)果 P16蛋白的表達(dá)與分布與CIN形態(tài)學(xué)分級之間有較好的一致性。SOX2陽性細(xì)胞在鱗狀上皮中的分布與CIN的分級趨向一致。P53蛋白和Ki-67指數(shù)與CIN的分級趨向一致。結(jié)論 在臨床實踐中，對于子宮頸小樣本活檢的CIN的分級，將HE染色的形態(tài)學(xué)觀察與P16、P53、SOX2及Ki-67的免疫組化檢查相結(jié)合，可獲得比較客觀的明確診斷，且重復(fù)性較好。

子宮頸活檢；上皮內(nèi)瘤變；P16；P53；SOX2；Ki67

(ChinJLabDiagn,2017,21:0942)

子宮頸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，盡管早期發(fā)現(xiàn)早期治療已經(jīng)取得了明顯的成效，但其死亡率仍居我國女性惡性腫瘤死亡率的前10位[1]。子宮頸活檢是目前確定子宮頸癌最為可靠的方法，即所謂“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是，在臨床病理診斷的實踐中，對于小樣本活檢確定子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)，或稱低級別/高級別上皮內(nèi)瘤變、原位癌以及浸潤癌時，還是面臨著一定的困境，尤其是CIN分級的確定。不同醫(yī)院的病理科醫(yī)生，甚至同一醫(yī)院的病理科醫(yī)生由于經(jīng)驗的不同，僅通過HE染色切片對同一病例的CIN分級判斷會有較大的差別。例如，有的病例，一部分醫(yī)生會診結(jié)果是考慮宮頸腺體發(fā)生鱗狀上皮化生，另外一部分醫(yī)生則診斷考慮為CIN Ⅲ級，這就給臨床醫(yī)生選擇治療方案帶來困惑。明確的診斷是治療的前提，不同的CIN分級，所選擇的治療方案也有所不同。在受檢材料有限的情況下，如何借助現(xiàn)有的先進(jìn)手段，盡可能為臨床治療提供準(zhǔn)確的CIN分級，是本文試圖解決的科學(xué)問題。

免疫組化染色技術(shù)在臨床病理診斷中已經(jīng)應(yīng)用的非常廣泛了而且也已成為診斷所依靠的重要條件之一。P16蛋白、P53蛋白等在子宮頸CIN中的表達(dá)及臨床價值已有大量的文獻(xiàn)報告[2]，但還缺乏比較一致的意見，并且重復(fù)性較為欠缺，即同一個病例不同的病理醫(yī)師可能給出不同的意見。本研究擬從HE染色的形態(tài)學(xué)變化結(jié)合P16、P53和SOX2蛋白的表達(dá)以及Ki-67指數(shù)的結(jié)果，綜合確定CIN的分級，以探索更為客觀可行的診斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集武漢市普愛醫(yī)院和江大病理診斷所2013年1月-2015年6月子宮頸活檢病例92例，年齡為32-69歲，平均年齡為48.5歲。其中CIN 1級19例，CIN 2級11例，CIN 3級(子宮頸鱗狀細(xì)胞原位癌)62例，全部病例有完整的臨床信息和隨訪資料，并且未做過任何放化療等。全部病例均經(jīng)兩位病理醫(yī)師復(fù)核診斷且符合研究要求。所有樣本均為常規(guī)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋的組織。

1.2 免疫組化染色檢查 操作程序按照免疫組化染色質(zhì)量控制要求執(zhí)行。P16抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(克隆號：3G5D5)，P53抗體為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品(克隆號：4A8)，SOX2抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(克隆號：EP103)，Ki-67抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(克隆號：UMAB107)。SupePictureTM 3rd Gen IHC Detection Kit為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(產(chǎn)品編號：87-8973)。濃縮型DAB試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(產(chǎn)品編號：ZLI-9017)。

1.3 P16以細(xì)胞漿呈現(xiàn)棕黃色為陽性，P53、SOX2及Ki-67以細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色為陽性。根據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行分級：每張切片上觀察5個高倍視野(*200)，計數(shù)陽性細(xì)胞百分比，陽性細(xì)胞數(shù)<5% 為0分，5%-25% 為1分，26%-50% 為2分，51%-75% 為3分，76%-100% 為4分。②陽性著色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。③ 兩者計分相乘即為陽性等級：0分為陰性(-)，1-4分為弱陽性(+)，5-12分為陽性(++)。Ki-67以陽性細(xì)胞占統(tǒng)計細(xì)胞總數(shù)的百分比表示。

1.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計軟件SPSS17.0 處理，蛋白表達(dá)與形態(tài)學(xué)變化的相互關(guān)系分析用卡方檢驗，以P值≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征 全部病例均為子宮頸小樣本活檢組織，出現(xiàn)典型的鱗狀上皮化生伴有不典型增生，CIN 1級為不典型增生病變累及鱗狀上皮全層下1/3，CIN2級為病變累及鱗狀上皮全層下2/3，CIN3級為病變累及鱗狀上皮2/3以上至全層，未突破基底膜。不典型增生的細(xì)胞核大深染，可見核分裂，CIN3級細(xì)胞異型性明顯，排列紊亂。

2.2 P16、SOX2、P53蛋白表達(dá)及Ki-67增殖指數(shù)與CIN分級 全組病例中，19例CIN1級中僅有1例P16蛋白陽性，且陽性細(xì)胞位于鱗狀上皮的底層，陽性信號也比較弱。62例CIN3級的病例中，51例均為強陽性表達(dá)，并且陽性信號均為鱗狀上皮全層(圖1)，提示P16蛋白的表達(dá)與分布與CIN形態(tài)學(xué)分級之間有較好的一致性。SOX2蛋白定位于細(xì)胞核，本組病例中，62例CIN3級的病例中，49例SOX2為強陽性表達(dá)，并且陽性信號均為鱗狀上皮全層(圖1)，11例CIN2級的病例中，8例為陽性表達(dá)，SOX2陽性細(xì)胞在鱗狀上皮中的分布與CIN的分級趨向一致，尤其是CIN2級和CIN3級。P53蛋白定位于細(xì)胞核(圖1)，在CIN1級和CIN2級中陽性細(xì)胞比例低于CIN3級，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本組資料中Ki-67指數(shù)以20%為界分組(圖1)，與CIN形態(tài)學(xué)分級間有明確關(guān)系(表1)。

表1 子宮頸組織中P16，SOX2及P53蛋白的表達(dá)與CIN分級

3 討論

3.1 P16蛋白與HPV的感染 HPV在子宮頸癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其中HPV16/18型被認(rèn)為是最常見的高危險亞型[2]。在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，HPV16/18型被檢出的頻率很高，雖然缺乏HPV感染導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的直接證據(jù)，但其作為一種非常常見的伴隨現(xiàn)象已有大量的證據(jù)。P16蛋白作為HPV轉(zhuǎn)染子宮頸細(xì)胞的重要分子標(biāo)志物，在細(xì)胞內(nèi)的積聚，使得我們可以用免疫組化染色的方法，清晰地觀察到[3]。因此，在子宮頸細(xì)胞癌變的過程中，我們可以通過P16蛋白的表達(dá)，獲得HPV轉(zhuǎn)染細(xì)胞的證據(jù)。

3.2 慢性子宮頸炎伴有CIN時，對于分級的判斷，僅依據(jù)形態(tài)學(xué)的觀察，常常有一定的困難，尤其是小樣本活檢，鑒于組織小而且局限，重復(fù)性不夠好。HPV16/18型原位雜交的結(jié)果可證實有無HPV轉(zhuǎn)染，但對于CIN分級的評價尚不明確。因為，雜交信號與CIN的形態(tài)學(xué)分級之間似乎缺乏一致性，尤其是表層細(xì)胞的陽性率比較低。從我們的研究結(jié)果來看，P16蛋白陽性表達(dá)的分布方式與CIN1-3級形態(tài)學(xué)變化之間有良好的相關(guān)性。即CIN1級，P16蛋白在鱗狀上皮的下1/3層細(xì)胞表達(dá)或不表達(dá)，在CIN2級則在鱗狀上皮2/3層以內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)，CIN3級則為2/3以上至全層彌漫陽性，與文獻(xiàn)報道相一致[4]。因此，在臨床病理診斷實踐中，利用P16蛋白作為診斷CIN分級的客觀指標(biāo)之一，有著重要的臨床意義。

圖1A 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌，SOX2呈胞核彌漫陽性。圖1B SOX2蛋白在CIN1級(低級別上皮內(nèi)瘤變)中的表達(dá)，呈胞核陽性。 圖1C P53蛋白在CIN1級(低級別上皮內(nèi)瘤變)中的表達(dá)，呈胞核陽性。圖1D SOX2蛋白在CIN2級中的表達(dá)，呈胞核陽性。 圖1E ki-67蛋白在CIN2級中的表達(dá)，呈胞核陽性。圖1F P16蛋白在CIN2級中的表達(dá)，呈胞漿陽性。圖1G SOX2蛋白在 CIN3級(高級別上皮內(nèi)瘤變)中的表達(dá)，呈胞核陽性。圖1H P16蛋白在CIN3級(高級別上皮內(nèi)瘤變)中的表達(dá)，呈胞漿陽性。 圖1I P53蛋白在CIN3級(高級別上皮內(nèi)瘤變)中的表達(dá)，呈胞核陽性。

圖1 P16，P53，SOX2和Ki67在宮頸上皮組織CIN病變中的表達(dá)

3.3 SOX2蛋白與CIN分級 SOX2是非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、DNA的損傷修復(fù)以及多種腫瘤干細(xì)胞的自我更新方面發(fā)揮重要作用[5]。近期文獻(xiàn)報告，SOX2蛋白的表達(dá)與子宮頸癌的形成、宮頸癌細(xì)胞株的侵襲轉(zhuǎn)移及腫瘤干細(xì)胞的自我更新相關(guān)[6]。本組的結(jié)果顯示，SOX2蛋白在CIN2-3級(即高級別上皮內(nèi)瘤變)中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與形態(tài)學(xué)變化有比較好的一致性。但在浸潤性鱗癌中的表達(dá)下降(數(shù)據(jù)未顯示)，與文獻(xiàn)不一致[7]，可能與入選的病例數(shù)量有限相關(guān)，需要進(jìn)一步證實。

3.4 形態(tài)學(xué)觀察與免疫組化檢查結(jié)果的綜合評價 本項研究結(jié)果顯示，在子宮頸小樣本活檢的臨床實踐中，對于CIN的分級，若將HE染色的形態(tài)學(xué)觀察與P53，Ki67，P16和SOX2的免疫組化檢查相結(jié)合，可獲得比較客觀的明確診斷，并且具有重復(fù)性好的特點。

[1]2013中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒http://www.nhfpc.gov.cn/htmlfiles/zwgkzt/ptjnj/year2013/index2013.html

[2]Zhang G,Yang B,Abdul-Karim FW.p16 Immunohistochemistry is useful in confirming high-grade squamous intraepithelial lesions (HSIL) in women with negative HPV testing[J].Int J Gynecol Pathol,2015,34(2):180.

[3]Wentzensen N,von Knebel,Doeberitz M.Biomarkers in cervical cancer screening[J].Dis Markers,2007,23(4):315.

[4]Capobianco G,Marras V,Wenger JM,et al.P16 immunostaining and HPV testing in histological specimens from the uterine cervix[J].Eur J Gynaecol Oncol,2013,34(3):227.

[5]Peng C,Li N,Ng YK,et al.A unilateral negative Feedback loop between miR-200 microRNAs and Sox2/E2F3 controls neural progenitor cell-cycle exitand differentiation[J].J Neurosci,2012,32(38):13292.

[6]Ji J,Zheng PS.Expression of Sox2 in human cervical carcinogenesis [J].Hum Pathol,2010,41(10):1438.

[7]Chang X,Zhang J,Huang C,et al.Sex-determining region Y-related high mobility group box (SOX)-2 is overexpressed in cervical squamous cell carcinoma and contributes cervical cancer cell migration and invasion in vitro[J].Tumour Biol,2015,36(10):7725.

Significance of P16 and SOX2 protein in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplastic

GUIHua-wei1,WANGXu-ming2,HUANGLi-hua1,etal.

(1.DepartmentofPathology,WuhanPuaiHospital;2.Departmentofhistopathology,JiangdaPathologyInstitute,Wuhan430056,China)

Objective To study the relationship between the expression of P16,P53,SOX2 and Ki67 and cervical CIN lesion.Methods To examine the expression of P16,P53,SOX2 and Ki-67 in 92 cases of cervical CIN lesions by immunohistochemistry,and analyze the correlation between the expression of and CIN classification.Results There was a good agreement between the expression and distribution of P16 protein and the morphological classification of CIN.The distribution of SOX2 positive cells in the squamous epithelium was consistent with the CIN classification.The clear relationship between P53 protein and Ki-67 index and CIN morphological classification has also been shown.Conclusion The combination of immunohistochemical examination of hematoxylin and eosin staining of morphological observation and P16 and P53 and SOX2 and Ki-67 get clear diagnosis more objective and repeatable in clinical practice for the classification of cervical small biopsy samples of CIN.

Cervical biopsy；Intraepithelial neoplastic；P16；P53；SOX2；Ki67

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81272754)

*通訊作者

1007-4287(2017)06-0942-04

R737.33

A

桂華偉，男，40歲，病理醫(yī)師，研究方向：腫瘤發(fā)病機(jī)制。參考文獻(xiàn)：

2016-12-18)