耐氟康唑白色念珠菌的耐藥性分析及中藥篩選研究

葉瑜劍 周芳美 許愛娥

·實驗研究·

耐氟康唑白色念珠菌的耐藥性分析及中藥篩選研究

葉瑜劍 周芳美 許愛娥

目的 探討更高效價的中藥抑制耐氟康唑白色念珠菌的方案。方法 藥敏紙片瓊脂擴散法篩選出臨床耐氟康唑白色念珠菌菌株，同時統(tǒng)計其臨床耐藥率。采用水提醇沉法提取5種單味藥及兩兩配伍藥物的提取液，體外測定黃連等5種中草藥單獨及等比例兩兩配伍情況下對白色念珠菌的最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果 臨床分離的29株菌中耐藥6株（20.7%），中介9株（31.03%），敏感14株（48.3%）。對耐藥6株菌，黃芩單藥提取液有較強抑菌效果，MIC為1.95～7.81mg/ml；黃連單藥提取液的MIC為0.976～31.6mg/ml；五倍子單藥提取液的MIC為15.6～62.5mg/ml；黃柏單藥的MIC為31.28～125mg/ml；知母單藥提取液的MIC為＞500mg/ml；復方藥（黃連和黃柏、黃連和知母）均有一定的抑菌效果，MIC分別為7.81～62.5mg/ml、15.6～62.5mg/ml。結(jié)論 臨床中白色念珠菌耐藥率為20.7%，黃連、黃芩、黃柏和五倍子四種中草藥具有直接的抗耐藥白色念珠菌的作用，其中尤以黃芩的抑菌作用最為顯著；復方藥黃連加黃柏、黃連加知母均有一定的抑菌效果。

中草藥 白色念珠菌 耐藥 最低抑菌濃度

念珠菌是正常人口腔、消化道及陰道黏膜常見的寄生菌，僅在適宜的條件下造成對宿主的感染，又稱條件致病菌。近年來，隨著廣譜抗生素、類固醇激素、免疫抑制劑和放射治療的廣泛應用，使臨床上念珠菌感染日益增多。文獻報道［1］，白色念珠菌是臨床上真菌感染的主要病原菌之一。隨著氟康唑的廣泛應用，臨床標本中耐藥白色念珠菌菌株檢出率逐漸升高［2］。研究表明［3］中藥不僅具有比較好的抑菌及殺菌作用，且不易產(chǎn)生穩(wěn)定可遺傳的耐藥菌株。因此，人們對從傳統(tǒng)天然藥物特別是中草藥中尋找抗微生物感染的新藥越來越關(guān)注［4］。本文選取甲癬患者指甲的白色念珠菌進行耐藥性分析，探討對耐藥氟康唑白色念珠菌作用較強的中藥，為抗真菌新藥的開發(fā)提供線索思路。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選擇2013年1月至2014年12月杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科甲癬患者指甲處經(jīng)分離、培養(yǎng)、鑒定后確定為白色念珠菌的標本29例，藥敏試驗的質(zhì)控菌克柔念珠菌ATCC2658、近平滑念珠菌ATCC22019，均由浙江中醫(yī)藥大學微生物與免疫學實驗室提供。

1.2 藥物及儀器 （1）含抗生素藥敏紙片：氟康唑購自杭州微生物試劑有限公司。（2）中藥：黃連、黃柏、知母、黃芩、五倍子，購自浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院。（3）培養(yǎng)基：改良沙氏培養(yǎng)基（SDA）：葡萄糖40g，蛋白胨10g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，115℃滅菌15min；Mueller-Hinton 瓊脂（補充2% 的葡萄糖和0.5μg/ml的美藍）；RPMI 1640液體培養(yǎng)基：RPMI 1640（含谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉）10.49，MOPS 34.59（0.165mol/L），加三蒸水900ml溶解，調(diào)pH至7.0，定容至1000ml，0.22μm濾膜濾過除菌，4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆茫?］。（4）主要儀器：生物安全柜（廣州三元科技有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（R-201，上海申順生物科技有限公司）、智能生化培養(yǎng)箱（SPX-280，Safe賽福）、低速自動平衡離心機（LDZ5-2，北京醫(yī)療離心機廠）、單相電容運轉(zhuǎn)電動機（JX5024，上海申順生物科技有限公司）、恒溫水浴鍋（W201B，上海申順生物科技有限公司）等。

1.3 方法 （1）藥敏紙片瓊脂擴散法篩選耐藥菌［6］：參照藥敏試驗NCCLS M44-P紙片擴散法，將所有白色念珠菌菌株做體外藥物敏感實驗，將純化的白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物配制成0.5麥氏單位濃度，用無菌棉簽涂布接種于MH培養(yǎng)基上，放置10min后，用無菌鑷子將藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基表面，35℃培養(yǎng)，18～24h后，測定抑菌圈直徑大小，參照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）標準判斷為敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）?？巳崮钪榫鶤TCC2658、近平滑念珠菌ATCC22019，作為質(zhì)控菌。（2）中藥有效成分的提取制備：采用水提醇沉法提取中藥有效成分［7］：分別取黃連、黃柏、黃芩、知母、五倍子［4］各50g，各加1000ml蒸餾水浸泡30min，煎1h，過濾。濾渣再加適量蒸餾水煎30min，過濾合并藥液，然后濃縮藥液至100ml，再加200ml 95%乙醇溶液，加時不斷攪拌，析出雜質(zhì)。靜置24h，過濾后恒溫水浴蒸發(fā)乙醇，乙醇蒸發(fā)完畢再加蒸餾水定容至50ml，可得1g/ml生藥液，115℃，15min滅菌4℃冷藏備用。兩兩配伍藥液制取方法是，取黃連和黃柏藥品各25g、黃連和知母藥品各25g，制取方法同上。（3）最低抑菌濃度（MIC）的測定：按照NCCLS M27-A采用肉湯稀釋法［5］：將中藥提取液用配制好的RPMI1640液倍比稀釋，使其終濃度（mg/ml）為500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.81、3.91、1.95、0.976。將待檢菌株接種在SDA培養(yǎng)基上，活化2次，以保證其純度和活性。用0.85%的鹽水制成酵母菌懸液，調(diào)整其濁度達0.5麥氏比濁標準［約為（1～5）×106CFU/ml］。用RPMI1640液體稀釋1000倍接種濃度約為（1～5）×103CFU/ml。在無菌聚苯乙烯板條各孔中加入各種不同濃度的中藥稀釋液100μl，各孔再加入待檢菌100μl，另設一孔不加藥液作為空白對照。每種菌株做一行復孔，平行操作一次。35℃孵育48h。結(jié)果判定：將測試孔菌株生長情況與對照孔進行比較，以培養(yǎng)液清澈為陰性，記為無菌落生長；混濁有菌膜為陽性，記為有菌落生長。以培養(yǎng)液清澈的最小濃度作為該藥的最低抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果

2.1 白色念珠菌的耐藥結(jié)果 參照NCCLS氟康唑藥敏紙片判讀標準：敏感≥19mm，中介15～18mm，耐藥≤14mm。結(jié)果顯示，29株白色念珠菌菌，耐藥6株（20.7%），中介9株（31.03%），敏感14株（48.3%），見表1。

表1 白色念珠菌的耐藥結(jié)果

2.2 抗耐藥氟康唑中藥篩選結(jié)果 紙片擴散法篩選耐藥菌株的基礎上，對耐藥菌株進行中藥篩選。孵育48h后，菌株生長良好，MIC終點清楚，標準菌均在質(zhì)控范圍內(nèi)。結(jié)果單藥提取液中，黃芩提取液的抑菌效果最強，其次為黃連提取液和五倍子提取液，兩兩配伍提取液均有一定的抑菌效果，但效果一般。見表2。

表2 中藥對耐藥菌株的MIC值

3 討論

白色念珠菌是存在于人體的正常真菌，屬于條件致病性真菌。當人體免疫抵抗能力較弱等情況時，會引起白色念珠菌的機會性感染。隨著艾滋病感染率逐年增高、腫瘤患者化療藥物的治療、器官移植免疫抑制劑的使用增加及抗生素的濫用，導致臨床上真菌感染率上升，且深部真菌感染病情較嚴重，病死率高。隨著氟康唑的廣泛應用，臨床標本中耐藥白色念珠菌菌株檢出率逐漸升高，本資料中臨床分離的白色念珠菌的耐藥率達20.7%。

中藥不僅具有比較好的抑菌及殺菌作用，且不易產(chǎn)生穩(wěn)定可遺傳的耐藥菌株。在大量的中藥體外藥敏試驗中發(fā)現(xiàn)不少中草藥具有較好的抑殺真菌作用。本資料結(jié)果顯示，黃連、黃芩、黃柏和五倍子四種中草藥具有直接的抗耐藥白色念珠菌的作用，其中尤以黃芩的抑菌作用最為顯著，知母作用效果較差；復方藥黃連加黃柏、黃連加知母均有一定的抑菌效果。馬廉蘭等［8］的實驗發(fā)現(xiàn)，黃連、黃芩、大黃、知母等中草藥對白色念珠菌和新生隱球菌均有較強的抑菌作用，其中黃連的抑菌作用最強，MIC最低。邱瑩等［9］根據(jù)對20種單味中藥的抑菌實驗結(jié)果選取6種抑菌效果最好的中藥（大風子、皂 角、川椒、藿香、地骨皮）組成復方，復方對各類真菌均有較好抑制作用，抑菌強度好于單味藥，對白色奶念珠菌也有較好的抑菌效果。余園媛［10］選用白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌三種耐藥菌株，觀察復方黃連凝膠劑對真菌和細菌感染的治療效果。結(jié)果顯示，復方黃連凝膠劑對三種多重耐藥菌株均有良好的抗菌作用，尤其是對白色念珠菌引起的感染效果更加明顯。Giordani R等［11］實驗發(fā)現(xiàn)，若實驗組中含有少量肉桂精油，便可以促使兩性霉素B對白色念珠菌的抑制作用更為顯著。

本資料結(jié)果對外敷中藥的研究有一定的指導意義，這不僅可降低西藥的治療量，還可減少不良反應，增強殺菌效果并防止耐藥性發(fā)生。在今后的研究中，適當增加中藥藥理作用機制的研究和臨床療效的評價，使中藥這種安全有效、不易出現(xiàn)耐藥性的治療方法更高效、更廣泛地應用于臨床皮膚病治療。

［1］ 任南,文細毛.白色念珠菌致病機制的研究進展.中國感染控制雜志, 2003, 2(2):157-158.

［2］ Mavor AL, Thewes S, Hube B.systemic fungal infections caused by Candida species: epidemiology, infection process and virulence attributes.Curt Drug Targets, 2005, 6(8): 863-874.

［3］ 陳奇. 中藥藥理研究方法學. 北京: 人衛(wèi)生出版社, 1993.

［4］ 宮毓靜, 安汝國.164種中藥乙醇提取物抗真菌作用研究. 中草藥, 2002, 33(1): 42-47.

［5］ Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast: Approved standard M27-A. The Nation Committee for Clinical Laboratory Standards.Pennsylvania, 1997: 1-21.

［6］ NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Twelfth Informational Supplement, 2002, 22(1): 48-49.

［7］ 王文花, 李勁松, 肖晴晴, 等. 5種中藥體外抗白色念珠菌的實驗研究. Journal of Guangxi Traditiona1 Chinese Medical University, 2010, 13(3): 54-55.

［8］ 馬廉蘭, 鐘有添. 六種中草藥對深部感染真菌的體外抑菌效果.贛南醫(yī)學院學報. 2001, 21(1): 1-3.

［9］ 邱瑩, 于騰. 20種中藥及其復方抗真菌實驗研究. 濟寧醫(yī)學院學報, 2007(3): 237-238.

［10］ 于園媛.復方黃連凝膠劑體內(nèi)抗菌活性研究.中國醫(yī)藥指南, 2008, 18(6): 47-50.

［11］ Giordani R, Regli P. Potentiation of antifungal activity of amphotericin B by essential oil from Cinnamomum eassia. Phytother, 2006, 20(1): 58-61.

Objective To investigate a method which can strongly inhibit clinically fl uconazole-resistant Candida albicans by using Chinese herbs. Methods The clinically fl uconazole-resistant Candida albicans were picked out，and the clinical resistance rate were calculated by using the K-B way. Ethanol subsiding methods were used to extract the extraction solvent of fi ve single herbs and two two compatibility herbs. Double dilution method was used to dilute the extraction solvent. At last，f i ve single herbs and two two compatibility herbs minimum inhibitory concentration（MIC）of Candida albicans were determined respectively in vitro. Results There were 6 resistant strains（20.7%），15 intermediary strains（51.7%）and 8 sensitive strains（27.6%）in total 29 strains of Candida albicans. Extracts from scutellaria baicalensis georgi and coptis root had strong inhibitory effect on 6 resistant strains，the MIC were 1.95-7.81mg/ml and 0.976-31.6mg/ml respectively. While extracts of Galla chinensis and Phellodendron bark had a little inhibitory effect on 6 resistant strains，the MIC were 15.6-62.5mg/ml and 31.28-125mg/ml respectively. Rhizoma anemarrhenae extract had little inhibitory effect on 6 resistant strains，the MIC were＞500mg/ml. Two two compatibility herbs（Coptis root and Phellodendron bark，Coptis root and Rhizoma anemarrhenae）had a little inhibitory effect on 6 resistant strains，the MIC were 7.81-62.5mg/ml、15.6-62.5mg/ml respectively. Conclusion The fl uconazole-resistant rate and fl uconazole-intermediary rate of Candida albicans are always high，while the fl uconazole- sensitive rate is always low. Coptis root，scutellaria baicalensis georgi，Phellodendron bark and Galla chinensis all have direct anti- fl uconazole-resistant Candida albicans effects. Scutellaria baicalensis georgi has most inhibitory effect on fluconazole-resistant Candida albicans，while Rhizoma anemarrhenae has little inhibitory effect. Two two compatibility herbs（Coptis root and Phellodendron bark，Coptis root and Rhizoma anemarrhenae）have a little inhibitory effect on fl uconazole-resistant Candida albicans.

Chinese traditional herbs Candida albicans Drug resistance Minimum inhibitory concentration（MIC）

浙江省教育廳一般科研項目（Y201431631）

310009 杭州市第三人民醫(yī)院（葉瑜劍 許愛娥）310053 浙江中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術(shù)學院（周芳美）