自身免疫抗體檢測在惡性血液疾病的臨床應(yīng)用研究

鐘智強(qiáng) 吳書玲 孫明洪 駱 豐 沈建平

自身免疫抗體檢測在惡性血液疾病的臨床應(yīng)用研究

鐘智強(qiáng) 吳書玲 孫明洪 駱 豐 沈建平

目的 評價自身免疫抗體檢測在惡性血液疾病診療中的臨床價值。方法 回顧分析2012年1月至2016 年6月453例血液疾病患者外周血ANA、anti-MPO、anti-PR3、AIHA-IgG、PAIg檢測結(jié)果，采用間接免疫熒光法檢測ANA，免疫印記法檢測anti-MPO、anti-PR3、PAIg，抗人球蛋白試驗(yàn)檢測AIHA-IgG，同時比較外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)與自身免疫抗體之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果 MDS和CLL患者自身免疫抗體陽性率高于其它惡性血液疾病，分別占29.7%和27.5%；在所檢測自身免疫抗體中ANA陽性率最高，占11.7%，Anti-PR3陽性率最低，占2.6%；自身免疫抗體陽性CLL患者RBC和PLT計(jì)數(shù)較陰性患者低，而自身免疫抗體陽性MDS患者WBC計(jì)數(shù)較陰性患者低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 MDS和CLL較其它惡性血液疾病更易并發(fā)自身免疫反應(yīng)，且與患者外周血細(xì)胞減少相關(guān)，自身免疫性抗體檢測有助于加深臨床對MDS和CLL的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，幫助臨床根據(jù)不同患者自身免疫狀況采取相應(yīng)治療方案。

自身免疫 抗核抗體 抗蛋白酶3抗體 抗髓過氧化物酶抗體 血小板相關(guān)抗體

惡性血液疾病是發(fā)生在造血干細(xì)胞水平的惡性克隆性疾病，可涉及多個細(xì)胞系。患者常會出現(xiàn)異?？寺〖?xì)胞增殖失控與其它系血細(xì)胞數(shù)量減少共存，自身免疫及炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮重要作用。惡性血液疾病類型與自身免疫抗體的關(guān)聯(lián)性還有待研究，本文探討臨床常用自身免疫抗體檢測在常見惡性血液疾病外周血細(xì)胞減少方面的臨床價值。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2016年6月本院血液科就診的惡性血液疾病患者453例，男230例，女223例；年齡6～81歲，中位年齡47歲。包括急性髓系白血?。ˋML）82例、慢性髓系白血?。–ML）77例、骨髓增生異常綜合征（MDS）91例、急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）75例、慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）69例、多發(fā)性骨髓瘤（MM）59例。病例選擇參照《2008年WHO造血與淋巴組織腫瘤分類》各系惡性血液腫瘤發(fā)病率為標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均為初診并且就診前未曾使用影響血細(xì)胞數(shù)量的藥物。本項(xiàng)目經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 試劑與設(shè)備 EDTA抗凝真空采血管和分離膠促凝真空采血管購自奧地利Greiner Bio-One GmbH公司，抗核抗體（ANA）、抗髓過氧化物酶抗體（anti-MPO）、抗蛋白酶3抗體（anti-PR3）、血小板相關(guān)抗體（PAIg）試劑盒購自德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司，抗人球蛋白試劑購自上海血液生物醫(yī)藥有限公司，間接免疫熒光法采用日本OLMPUS BX51熒光顯微鏡檢測，全血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)采用美國Beckman Coulter DXH800血細(xì)胞分析儀檢測。

1.3 方法 （1）標(biāo)本處理：所有患者分別用EDTA抗凝管和分離膠促凝管采集外周靜脈血5～6ml?？鼓杉罅⒓搭嵉够靹?次，上機(jī)前再顛倒混勻5次，30min內(nèi)完成全血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)檢測。促凝血采集后靜置20～30min，3000r/min離心10min后分離血清，置于4℃冰箱保存，24h內(nèi)完成ANA、anti-MPO、anti-PR3、PAIg檢測?？谷饲虻鞍卓贵w于采血后3h內(nèi)完成檢測。（2）全血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)檢測：血細(xì)胞計(jì)數(shù)采用COULTER電阻抗原理，白細(xì)胞分類采用VCSn原理，每例患者全血標(biāo)本連續(xù)檢測3次取平均值，按照本科室SOP文件進(jìn)行操作，儀器配套質(zhì)控品顯示室內(nèi)質(zhì)控滿意符合要求。（3）自身免疫抗體檢測：ANA檢測采用間接免疫熒光法，anti-MOP、anti-PR3、PAIg檢測采用免疫印跡法，測定值以定性表示（陰性或陽性），所有操作嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行，采用試劑盒自帶陰性和陽性對照作為室內(nèi)質(zhì)量控制。自身免疫性溶血性貧血抗體（AIHA-IgG）采用直接抗人球蛋白試驗(yàn)（DAGT），采用同型健康體檢者洗滌紅細(xì)胞作為陰性對照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用（x±s）表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自身免疫抗體檢測結(jié)果 在疾病類型方面，MDS和CLL自身免疫抗體陽性人數(shù)比例最高，分別為29.7%、27.5%。在所檢測自身免疫抗體中ANA陽性率最高，占11.7%，其次是PAIg陽性率6.2%，AIHAIgG陽性率4.0%，anti-MPO陽性率3.8%，Anti-PR3陽性率最低，占2.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、2。

表1 不同血液疾病自身免疫抗體陽性率比較

表2 不同類型自身免疫抗體陽性率比較［n（%）］

2.2 CLL患者外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 WBC計(jì)數(shù)在自身免疫抗體陽性與陰性間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），自身免疫抗體陽性CLL患者RBC和PLT計(jì)數(shù)較自身免疫抗體陰性患者低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 CLL患者自身免疫抗體陽性與陰性外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（x±s）

2.3 MDS患者外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 自身免疫抗體陽性MDS患者WBC計(jì)數(shù)比陰性患者低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而RBC和PLT計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 MDS患者自身免疫抗體陽性與陰性外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（x±s）

3 討論

較多惡性血液疾病易并發(fā)自身免疫反應(yīng)，其中抗體介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用，包括常見的自身免疫性血細(xì)胞減少、血管炎等，有時甚至成為疾病首發(fā)臨床表現(xiàn)。本資料顯示常見髓系和淋系惡性疾病中均可檢出自身免疫性抗體，但總體陽性率并不高，從2.6%～29.7%。MDS是一組克隆性造血干細(xì)胞疾病，以髓系血細(xì)胞減少或發(fā)育異常、無效造血及急性白血病發(fā)病風(fēng)險增高為特征［1］。較多患者出現(xiàn)固有免疫和適應(yīng)性免疫異常，從而出現(xiàn)自身免疫和炎癥反應(yīng)，據(jù)報道其發(fā)病率7%～25%［2］。本資料顯示MDS患者自身免疫抗體陽性率29.7%，在惡性血液疾病中自身免疫抗體陽性率最高，也高于相關(guān)文獻(xiàn)報道的發(fā)病率，這可能與研究人群構(gòu)成有關(guān)，且MDS是一種強(qiáng)異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制仍未闡明，診斷標(biāo)準(zhǔn)也在不斷完善。在自身免疫抗體譜方面MDS患者以ANA為主，占23.1%，與免疫性血細(xì)胞減少相關(guān)的自身抗體則處于低水平。27例自身免疫抗體陽性患者中有5例血管炎、1例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、2例過敏性紫癜、1例自身免疫性溶血性貧血，其余無明顯自身免疫臨床表現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)分析顯示MDS患者外周血RBC和PLT計(jì)數(shù)與自身免疫抗體陽性與陰性間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），針對血細(xì)胞膜抗原成分的自身免疫抗體檢出率與臨床表現(xiàn)并不一致，MDS患者DAGT試驗(yàn)陽性率5.5%高于實(shí)際AIHA發(fā)病率3.7%，同樣PAIg陽性率12.1%也高于實(shí)際過敏性紫癜發(fā)病率7.4%。雖然MDS存在自身免疫抗體但是出現(xiàn)自身免疫疾病并不常見，且以脈管炎及結(jié)締組織疾病為主要表現(xiàn)，這與抗體譜中陽性率以ANA和ANCA為主相關(guān)。然而，統(tǒng)計(jì)分析表明MDS患者自身免疫抗體陽性患者外周血WBC計(jì)數(shù)低于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MDS出現(xiàn)血細(xì)胞減少是多種因素綜合作用的結(jié)果，包括免疫下調(diào)、炎癥因子增加、基因改變等等。MDS患者存在多髓系來源抑制細(xì)胞和炎癥因子（如IL-10、TGF-β等）升高現(xiàn)象，這些抑制因素直接造成骨髓造血功能下降從而促進(jìn)了血細(xì)胞減少。此外，MDS患者常出現(xiàn)CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）異常。Treg細(xì)胞是一類調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞，其功能下降或數(shù)量減少促使自身免疫反應(yīng)發(fā)生，功能增強(qiáng)或數(shù)量增加則削弱機(jī)體免疫監(jiān)視促進(jìn)腫瘤生成。低風(fēng)險MDS患者Treg數(shù)量減少，高風(fēng)險MDS患者Treg數(shù)量增加且預(yù)后不良［3］。本資料顯示自身免疫抗體陽性的MDS患者主要以RCUD、RARS、RCMD類型為主，而高風(fēng)險RAEB類型在自身免疫抗體陰性MDS患者中比例相對增高，這與以往研究結(jié)果相符合，表明Treg細(xì)胞是部分MDS出現(xiàn)自身免疫反應(yīng)因素之一。此外，陽性患者常出現(xiàn)多個自身免疫抗體陽性，單獨(dú)出現(xiàn)較少見。

自身免疫反應(yīng)也是CLL最常見的并發(fā)癥，但是CLL不同于MDS，臨床通常以自身免疫性血細(xì)胞減少為主要表現(xiàn)，其中AIHA最常見，其次是ITP。CLL患者可以僅出現(xiàn)上述一種自身免疫性血細(xì)胞減少也可能同時存在多種，甚至出現(xiàn)EVan’s綜合征［4］。本資料顯示CLL自身免疫抗體陽性率為27.5%，在惡性血液疾病中位于第2位。自身免疫抗體陽性譜中則以ANA、AIHA-IgG和PAIgG為主，分別占15.9%、14.5%和18.8%，其中AIHA-IgG和PAIgG的靶抗原位于血細(xì)胞膜，能夠引起抗體所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答造成血細(xì)胞破壞，其是引起AIHA和ITP的主要機(jī)制［5］。19例自身免疫抗體陽性患者中僅11例出現(xiàn)AIHA和/或ITP臨床表現(xiàn)，其余8例無明顯臨床表現(xiàn)，主要以ANA陽性為主，也體現(xiàn)了血液疾病在發(fā)病機(jī)制上的部分共性。自身免疫抗體陽性CLL患者外周血RBC和PLT計(jì)數(shù)低于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明自身免疫反應(yīng)是CLL患者血細(xì)胞減少的因素之一。對存在自身免疫反應(yīng)的CLL患者，臨床醫(yī)師可以通過自身免疫性抗體檢測對患者進(jìn)行評估，采取適合的治療手段［6］。

除CLL和MDS外，其余四種常見惡性血液疾病的自身免疫抗體陽性率處于低水平，其中又以ANA陽性率相對偏高，這與臨床基本相符，即這些疾病臨床上并發(fā)自身免疫疾病幾率也較少。自身免疫和炎癥反應(yīng)貫穿于惡性血液疾病發(fā)生發(fā)展的整個過程，染色體與基因異常、免疫功能失調(diào)等都易引起自身免疫抗體產(chǎn)生，特別是MDS和CLL，臨床檢測自身免疫抗體不僅有助于疾病發(fā)病機(jī)制的研究，也為臨床進(jìn)行個體化治療方案決定提供幫助。

［1］ 張之南, 郝玉書, 趙永強(qiáng). 血液病學(xué). 第二版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011: 551-555.

［2］ Al Ustwani O, Ford LA, Sait SJ, et al. Myelodysplastic syndromes and autoimmune diseases-case series and review of literature. Leuk Res, 2013, 37(6): 894-899.

［3］ Ofir W, Richard S. autoimmunity and inflammation in myelodysplastic Syndromes. Acta Haematol, 2016, 136(6): 108-117.

［4］ Hodgson K, Ferrer G, Montserrat E, et al. Chronic lymphocytic leukemia and autoimmunity: a systematic review. Haematologica, 2011, 96(5): 752-761.

［5］ Kerry AR, Jennifer A, Woyach. Secondary autoimmune cytopenias in chronic lymphocytic leukemia, 2016, 43(3): 300-310.

［6］ Matthew K, Kanti R. The challenge of treating complex autoimmune cytopenias in chronic lymphocyteic leukemia, 2010, 5(4): 574-575.

Objective To evaluate the clinical signif i cance of autoimmune antibodies in the diagnosis and therapy of hematologic malignancies. Methods During the period of 2011 to 2016，453 patients with hematologic malignancies in Zhejiang provincial TCM hospital were enrolled in this retrospective analysis. The antibodies prof i les were tested for each patients by using immunoblotting and indirect immunof l uorescence. Results The positive rates of MDS and CLL were higher than those of other malignant hematologic diseases，accounting for 29.7%（27/91）and 27.5%（19/69）respectively. Among the detected autoimmune antibodies，ANA positive rate was the highest，accounting for 11.7%（53/453），while positive rate of Anti-PR3 was lowest，accounting for 2.6%（12/453）. RBC and PLT counts in CLL patients with positive antibodies were lower than in those with negative ones，and WBC count in MDS patients with positive antibodies was lower than in those with negative ones. Conclusions Autoimmunity is more frequently observed in CLL and MDS than other malignant hematologic diseases，associated with hemocytopenia. It’s helpful for clinical doctors to deepen the understanding of the pathogenesis of MDS and CLL，and to help clinical treatment according to different patients' immune status to detect the autoimmune antibodies.

Autoimmune ANA anti-PR3 Anti-MPO PA-IgG

310006 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院