Cd脅迫對(duì)水稻葉NR活性、GS活性和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

謝斯斯+盧維盛+吳道銘+鐘輝祥+陳遠(yuǎn)+陳偉彬+黃家歡+陳貴然+張慧敏+吳祝拓

摘要：通過(guò)盆栽試驗(yàn)，以秈稻培雜泰豐和粳稻日本晴為供試水稻品種，研究了Cd脅迫對(duì)水稻NR（硝酸還原酶）活性、GS（谷氨酰胺合成酶）活性和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，Cd脅迫對(duì)水稻葉GS活性和 NR活性均表現(xiàn)為低促高抑或抑制作用，在不同時(shí)期和不同品種間表現(xiàn)不同。隨環(huán)境（土壤）鎘濃度的上升，日本晴葉可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而培雜泰豐則保持上升趨勢(shì)。培雜泰豐比日本晴具有更高的Cd耐受能力。

關(guān)鍵詞：水稻；Cd脅迫；NR；GS；可溶性蛋白質(zhì)

中圖分類號(hào)：S161.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-672X（2017）03-0201-04

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.03.110

Abstract： Pot experiment was carried out to study the effect of cadmium（Cd） stress on NR activity ，GS activity and soluble protein content in rice leafes. The tested rice varieties were Peiza Taifeng and Nipponbare. The results showed that NR activity and GS activity all tended to promote weakly and inhibited with increase of Cd concentration. With the Cd application， the content of soluble protein in Nipponbare leafes firstly increased and then decreased， while Peizataifeng was to maintain an upward trend. Peizataifeng had higher Cd tolerance than Nipponbare.

Key Words： rice；N-Cd；NR；GS；soluble protein

近年來(lái)，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和城市化的發(fā)展，農(nóng)田土壤中重金屬污染問(wèn)題日益突出，進(jìn)而影響到我國(guó)的稻米質(zhì)量安全[1]。水稻作為我國(guó)最重要的糧食作物之一，對(duì)Cd具有較強(qiáng)的吸收和耐受能力[2]，存在稻米Cd超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)。小劑量鎘可提高或加速某些生理生化反應(yīng)，而大劑量則對(duì)植物產(chǎn)生抑制和毒害，有人把此現(xiàn)象解釋為鎘在低濃度時(shí)對(duì)植物有一定的“刺激作用” [3]。但重金屬不論其濃度如何，對(duì)植物的生理生化過(guò)程都是有害的，只不過(guò)植物對(duì)重金屬的反應(yīng)是一個(gè)過(guò)程中的兩種作用的復(fù)合效應(yīng)[4]。Cd可以通過(guò)影響游離氨基酸、可溶性蛋白含量以及植物體內(nèi)的酶系統(tǒng)而擾亂植物的各種生理生化代謝過(guò)程[5]，Cd對(duì)水稻毒害主要表現(xiàn)為氧化損傷，影響植物的抗氧化系統(tǒng)和光合作用、呼吸作用等生理代謝過(guò)程[6]。鎘脅迫造成植物體內(nèi)一些大量和微量元素吸收與分配發(fā)生混亂，其中氮代謝失調(diào)是植物鎘毒害的重要原因，氮素代謝作為植物生長(zhǎng)發(fā)育中一個(gè)重要的營(yíng)養(yǎng)代謝途徑，其多種中間代謝產(chǎn)物或含氮有機(jī)物對(duì)緩解環(huán)境不良因子起著重要的作用，鎘脅迫環(huán)境下植物保持正常的氮代謝是它對(duì)鎘毒害具有一定耐性的表現(xiàn)[7]。本試驗(yàn)選用秈稻培雜泰豐和粳稻日本晴為供試水稻品種，采用土培方法，研究了N-Cd交互處理對(duì)水稻氮代謝酶活性和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為培雜泰豐（秈稻）和日本晴（粳稻），種子由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。盆栽土壤取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田的農(nóng)田水稻土，土壤自然風(fēng)干后，過(guò)5mm篩。土壤基本理化性狀見表1，具體分析方法參見《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[8]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進(jìn)行。設(shè)4個(gè)Cd水平0.0、1.0、3.0和5.0 mg·kg-1土（以純Cd計(jì)，CdCl2·2.5H2O為Cd源），設(shè)2個(gè)氮（尿素為氮源）水平N100、N200 mg·kg-1土（以純N計(jì)）。按照常規(guī)進(jìn)行水分管理。

1.3 測(cè)定

分別于抽穗期和成熟期取樣測(cè)定。采取葉鮮樣，將洗凈擦干的水稻新鮮綠葉，混勻后稱取約10g剪碎，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于酶活性測(cè)定。

1.3.1 硝酸還原酶（nitrate-reductase，NR）活性測(cè)定

0.5g水稻鮮葉+7.5ml提取緩沖液（1.211g半胱氨酸 + 0.372g EDTA，溶于1L 0.025 mol·L-1 pH8.7的磷酸緩沖溶液），研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中于4℃、4000 r·min-1下離心15min，上清液即為粗酶提取液。0.4ml粗酶提取液+1.2ml 0.1 mol·L-1 KNO3溶液+ 0.4mlNADH溶液后混勻（對(duì)照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1 mol·L-1 pH 7.5磷酸緩沖液代替），在25℃水浴中保溫30min。保溫結(jié)束后立即加入1ml磺胺溶液終止酶反應(yīng)，再加1ml 0.2% a-萘胺溶液，顯色反應(yīng)15min后于4000 r·min-1下離心5min，取上清液在540nm下比色測(cè)定吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算NR活性，單位表述為μg ·g-1·h-1[9]。

1.3.2 谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性測(cè)定

1g水稻鮮葉+8ml pH7.2磷酸提取液（0.146g EDTA·L-1提取液），研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中于4℃、18000 r·min-1下離心20min，上清液即為粗酶提取液。酶粗液1ml+0.6ml咪唑-鹽酸緩沖液（0.25mol·L-1，pH7.0）+0.4ml谷氨酸鈉溶液（0.30mol·L-1，pH7.0）+0.4ml ATP-Na溶液（30mmol·L-1，pH7.0）+0.2ml MgS04溶液（0.5 mol·L-1）。反應(yīng)液在25℃水浴中保溫5 min后，加入0.2ml羥胺試劑開始反應(yīng)，25℃水浴中保溫15 min后，立即加入1ml 酸性FeCl3試劑終止反應(yīng)?；旌弦涸?000 r·min-1離心15min，測(cè)定上清液在540nm處的光密度?？偦钚詾椋好靠缩r樣酶粗液在15min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)消光值的變化量，單位表述為△OD·g-1·min-1[10]。

1.3.3 可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定

0.2g水稻鮮葉+5ml磷酸提取液（pH7.0），研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中于4000 r·min-1下離心20min，上清液倒入10ml容量瓶中，定容至刻度。取 0.1ml 樣品提取液+0.9ml蒸餾水+ 5ml考馬斯亮藍(lán)G-250混勻，放置5min后在595nm下比色。根據(jù)回歸方程計(jì)算蛋白質(zhì)含量mg/g[9]。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中數(shù)據(jù)用Excel和SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻不同時(shí)期葉谷氨酰胺合成酶（GS）活性

從圖1和圖2可知，從抽穗期到成熟期，無(wú)Cd處理的水稻葉GS活性有所上升，而有Cd處理的葉GS活性明顯下降，Cd脅迫使水稻后期氮素同化能力下降。抽穗期，隨著Cd處理濃度上升，水稻葉GS活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但兩水稻品種葉GS活性對(duì)Cd處理的反應(yīng)不同，日本晴是在Cd 1.0 mg·kg-1土?xí)r升至最高后下降，而培雜泰豐是在Cd 3.0 mg·kg-1土?xí)r升至最高后有所下降。成熟期，Cd處理對(duì)水稻葉GS活性主要表現(xiàn)為抑制作用，尤其對(duì)培雜泰豐。

2.2 水稻不同時(shí)期葉硝酸還原酶（NR）活性

分析圖3和圖4可知，抽穗期兩品種水稻葉NR活性無(wú)明顯差異，但成熟期培雜泰豐葉NR活性顯著高于日本晴。從抽穗期到成熟期，水稻葉NR活性顯著下降，有Cd處理的下降幅度高于無(wú)Cd處理的。Cd處理對(duì)日本晴葉NR活性表現(xiàn)為抑制作用，而對(duì)培雜泰豐則表現(xiàn)為明顯的低促高抑。

2.3 水稻不同時(shí)期葉可溶性蛋白質(zhì)含量變化

由圖5和圖6可知，從抽穗期到成熟期，兩品種水稻葉可溶性蛋白質(zhì)含量明顯減少。隨Cd處理濃度的上升，日本晴葉可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而培雜泰豐則保持上升趨勢(shì)。

2.4 水稻葉GS活性、NR活性和可溶性蛋白質(zhì)含量的方差分析

由表2可知，水稻葉NR活性和可溶性蛋白質(zhì)含量與因素間存在顯著線性相關(guān)性。水稻葉GS活性、NR活性和可溶性蛋白質(zhì)含量隨時(shí)期的變化而明顯變化；Cd處理對(duì)水稻葉可溶性蛋白質(zhì)含量具顯著影響，培雜泰豐NR活性對(duì)Cd處理的響應(yīng)顯著高于日本晴，而日本晴GS活性對(duì)Cd處理的響應(yīng)顯著高于培雜泰豐的；N施用量對(duì)水稻GS活性和可溶性蛋白質(zhì)含量影響顯著，尤其對(duì)日本晴。

3 討論與結(jié)論

在脅迫條件下，必需元素尤其是硝酸鹽的變化，能引起基因表達(dá)和酶活性的變化，在一些植物中，鎘對(duì)硝酸鹽及其同化都產(chǎn)生影響[11]。谷氨酰胺合成酶（GS）是處于氮代謝中心的多功能酶，參與多種氮代謝的調(diào)節(jié)，其活性的高低可以反映氮素同化能力的強(qiáng)弱 [12]。硝酸還原酶（NR）是植物同化硝酸鹽的限速酶，以硝酸還原酶為中心的調(diào)控系統(tǒng)是植物最原始、最基本的氮代謝調(diào)控系統(tǒng)，在水稻氮素代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用[13]。有研究證實(shí)，細(xì)胞中可溶性蛋白質(zhì)含量的增加，一方面可與Cd2+ 形成鎘結(jié)合蛋白（Cd-BP），Cd-Bp的形成限制了自由態(tài)Cd2+的存在，減輕了鎘對(duì)植物的毒害；另一方面可提高功能蛋白的數(shù)量，增加細(xì)胞滲透勢(shì)，有助于維持細(xì)胞正常代謝，提高植物的抗逆性[14]。鎘脅迫下，水稻幼苗葉片可溶性蛋白含量、脯氨酸含量及硝酸還原酶活性明顯增加[15]。本研究表明，Cd處理對(duì)水稻葉可溶性蛋白質(zhì)含量具顯著影響，培雜泰豐NR活性對(duì)Cd處理的響應(yīng)顯著高于日本晴，而日本晴GS活性對(duì)Cd處理的響應(yīng)顯著高于培雜泰豐。從抽穗期到成熟期，無(wú)Cd處理的水稻葉GS活性有所上升，而有Cd處理的葉GS活性下降；葉NR活性明顯下降，但有Cd處理的下降幅度高于無(wú)Cd處理。Cd處理對(duì)水稻葉GS活性和 NR活性均表現(xiàn)為低促高抑或抑制作用，具體表現(xiàn)與時(shí)期和品種有關(guān)，對(duì)抽穗期水稻葉GS活性表現(xiàn)為明顯的低促高抑，而對(duì)成熟期水稻葉GS活性則主要表現(xiàn)為抑制作用；對(duì)日本晴葉NR活性主要表現(xiàn)為抑制作用，而對(duì)培雜泰豐則表現(xiàn)為低促高抑?？偟膩?lái)說(shuō)，培雜泰豐葉GS活性和 NR活性對(duì)Cd的耐受能力高于日本晴。隨環(huán)境（土壤）鎘濃度的上升，日本晴葉可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而培雜泰豐則保持上升趨勢(shì)。培雜泰豐比日本晴具有更高的Cd耐受能力。

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收稿日期：2017-05-12

作者簡(jiǎn)介：謝斯斯（1984-），女，碩士研究生，中級(jí)環(huán)保工程師，研究方向?yàn)榄h(huán)境保護(hù)。