紙片快速法與固定底物酶底物法測定環(huán)境水樣中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）的比較

傅德瑜+高倩倩+高韋韋

摘要：糞大腸菌群是環(huán)境水體中是否受到糞便污染的重要指標，紙片快速法和固定底物酶底物法是當今環(huán)境監(jiān)測廣泛采用的方法，采用兩種方法分別對標準菌株和實際水樣進行檢測，結(jié)果表明，紙片快速法和固定底物酶底物法用于糞大腸菌群的檢測結(jié)果具有一致性。

關(guān)鍵詞：紙片快速法；固定底物酶底物法；糞大腸菌群環(huán)境監(jiān)測精密度

中圖分類號：P332 文獻標識碼：A 文章編號：2095-672X（2017）03-0184-02

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.03.099

Abstract： Fecal coliforms are an important indicator of whether fecal contamination is caused by fecal water in the environment. The rapid method and the method of fixed substrate enzyme are widely used in environmental monitoring. Two methods are used to compare the standard strains and the actual water The results showed that the results of rapid method and fixed substrate enzyme method for fecal coliform bacteria were consistent.

Key words： paper fast method； fixed substrate enzyme substrate method； fecal coliform bacteria environmental monitoring precision

糞大腸菌群是總大腸菌群中的一部分，主要來自糞便。糞大腸菌群就是一種大腸菌群，這種大腸菌群溫度控制在44.5℃時能長出乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣并且發(fā)酵。利用改變溫度的培養(yǎng)方式，以制造一種對自然環(huán)境不適應的大腸菌群生長的條件，不利的自然環(huán)境條件，培養(yǎng)細菌主要來自糞便大腸桿菌細菌，以便更準確地反映糞便污染水質(zhì)的情況。目前針對環(huán)境水樣監(jiān)測指標中的糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）檢測，方法主要有紙片快速法、固定底物酶底物法和傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法及濾膜法，此四種方法被環(huán)境檢測部門廣泛采用，多管發(fā)酵法和濾膜法檢測時間較長，試驗步驟繁瑣，需驗證試驗，不能對水的衛(wèi)生狀況做出快速評價。紙片快速法、固定底物酶底物法操作簡單，檢測時間短，準確度高，但是固定底物酶底物法成本較高，而且未列入國標，紙片快速法列入環(huán)保行業(yè)標準方法（HJ/T 755-2015），現(xiàn)就紙片快速法和固定底物酶底物法做以下探討。

1 方法原理

1.1 紙片快速法原理

按MPN法，將一定量的水樣以無菌操作的方式接種到吸附有適量指示劑（溴甲酚紫和2，3，5-氯化三苯基四氮唑即TTC）以及乳糖等營養(yǎng)成分的無菌濾紙上，在特定的溫度（37oC或44.5oC）培養(yǎng)24h，當細菌生長繁殖時，產(chǎn)酸使pH值降低，溴甲酚紫指示劑由紫色變黃色，同時，氣體產(chǎn)生過程相應的合適的pH值范圍內(nèi)，脫氫酶催化脫氫還原TTC形式紅三苯不溶性甲咱（ttf），之后可以產(chǎn)生酸黃色背景顯示紅點（或液體）。通過以上的顏色變化指標來判斷是否產(chǎn)生酸產(chǎn)生氣體，以確定是否存在糞大腸菌群，檢查通過或然數(shù)表可以得出相應的糞便大腸桿菌細菌密度[1-2]。

1.2 固定底物酶底物法原理

根據(jù)大腸菌群能產(chǎn)生特異性的β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解MMO-MUG培養(yǎng)基中的色原底物ONPG（Ortho-nitropheny1-β-D-glucuronide）使培養(yǎng)液呈黃色，以及大腸埃希氏菌產(chǎn)生特異性的β-葡萄糖酸酶（β-glucuronidase）分解MMO-MUG培養(yǎng)基中的熒光底物MUG（4-methy1-umbelliferyl-β- D-glucuronide）使培養(yǎng)液在波長366nm紫外光下產(chǎn)生熒光的原理，來判斷水樣中是否含大腸菌群、糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）及大腸埃希氏菌。

2 材料與方法

2.1 試劑和材料

紙片快速法：水質(zhì)（糞）大腸菌群快速檢測紙片（廣州綠洲生化科技股份有限公司，型號為BD105I和BD105II）、無菌水。其它試劑按照《水質(zhì)總大腸菌群和糞大腸菌群的測定紙片快速法》（HJ/T 755-2015）準備。

固定底物酶底物法：科立得（Colilert）試劑、IDEXX 97孔定量盤、IDEXX智能封口機。

標準菌株采用科立得IDEXX-QC Fecal Coliform質(zhì)控標樣（產(chǎn)品編號98-29001-00，Lot # 122815）。

2.2 方法

2.2.1 紙片快速法檢測水中糞大腸菌群方法

根據(jù)《水質(zhì)總大腸菌群和糞大腸菌群的測定紙片快速法》（HJ/T 755-2015）方法上的接種參考表，對清潔水樣，接種水樣總量為55.5ml，大紙片5張，每張接種10ml水樣，小紙片10張，其中5張各接種水樣1ml，另5張各接種1：10的稀釋水樣1ml；受污染水樣，接種3個不同稀釋度的1ml稀釋水樣各5張。接種后的水樣紙片在44.5oC±0.5oC的條件中培養(yǎng)18～24h后觀察結(jié)果。并同步做空白對照。根據(jù)紙片變色程度判斷是否為陽性，查MPN表得到該水樣的MPN值，經(jīng)計算后可得出被測水樣的糞大腸菌群濃度。

2.2.2 固定底物酶底物法（Colilert法）測水中糞大腸菌群采用97孔定量盤法

本方法取水樣100ml，裝入100ml的無菌瓶，加入科立得試劑，搖勻使其全部溶解，轉(zhuǎn)入97孔無菌定量盤內(nèi)，用手撫平定量盤趕出氣泡，放入封口機封口。然后放入44.5℃±0.2℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進行結(jié)果判讀，如果結(jié)果為可疑陰性，可適當延長培養(yǎng)時間到28h，超過28h之后出現(xiàn)的顏色反應不作為陽性結(jié)果。將培養(yǎng)24h之后的定量盤取出觀察，如果孔穴內(nèi)的水樣變成黃色則表示該孔穴中含有糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）。計算黃色的孔穴數(shù)，對照MPN表查出其代表的糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）最可能數(shù)。

采用Excel軟件進行實驗數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計。

3 試驗結(jié)果和分析

3.1 精密度和準確度檢驗

采用科立得IDEXX-QC Fecal Coliform質(zhì)控標樣（產(chǎn)品編號98-29001-00，Lot # 122815），分別用快速紙片法和固定底物酶底物法進行平行雙樣的分析，所得結(jié)果均在標準證書所要求的可接受范圍內(nèi)（34-703 MPN/100ml），標準菌株均未出現(xiàn)假陽性或假陰性，相對標準偏差范圍為3.2%～4.7%，相對誤差范圍為-4.2%～3.5%，均在受控范圍內(nèi)。

3.2 水樣比對

采用快速紙片法和固定底物酶底物法對50份地表水和廢水樣品進行分析。為方便作圖和統(tǒng)計，將檢測結(jié)果取lg值來表示，兩種方法所測得的糞大腸菌群結(jié)果lgMPN值見圖1：

對兩種方法所得的數(shù)據(jù)結(jié)果進行配對t檢驗，為了使兩組數(shù)據(jù)成正態(tài)分布，先對數(shù)據(jù)進行取對數(shù)后再處理，結(jié)果如下：

由上表數(shù)據(jù)可以看出，相關(guān)系數(shù)r=0.9019，說明兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性很好，t=1.985，P值=0.285>0.05，說明兩種方法結(jié)果差異沒有顯著意義，可以認為紙片快速法和固定底物酶底物法所得檢驗結(jié)果沒有區(qū)別，等效。

4 討論

由表1中檢測結(jié)果數(shù)據(jù)可以看出，快速紙片法MPN值較固定底物酶底物法略低，主要原因是固定底物酶底物法的底物為鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG），能夠誘導樣品中的細菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，而具有β-半乳糖苷酶是腸桿菌群的重要特征之一[3]，而糞大腸菌群屬于腸桿菌群的一種，因此，檢測結(jié)果會高于紙片快速法。

紙片快速法和固定底物酶底物法均有操作步驟簡單，不需要進行確認實驗，檢測時間短等優(yōu)點，但是在技術(shù)難易和檢測費用兩個方面來說，快速紙片法檢測費用更低，只需購買檢測紙片，而固定底物酶底物法需購置封口設(shè)備和樣品瓶及昂貴的試劑。故紙片快速法更適合現(xiàn)階段環(huán)境監(jiān)測機構(gòu)的檢測需求。

注意事項：水樣在實驗前必須充分搖勻，以減少因菌群分布不均勻帶來的差異影響。因為要確保實驗結(jié)果的準確性，同時也是能方便統(tǒng)計，要求水樣有一定的陽性檢出率，同時，水樣的MPN值應盡量控制在2400以內(nèi)，因為MPN本身為統(tǒng)計得出，如樣品中菌數(shù)MPN值大于2400，由于樣品稀釋造成的分配不均導致的差異會比不稀釋的樣品大很多。

參考文獻

[1]朱培瑜，魏軻，固定底物酶底物法與多管發(fā)酵法和快速紙片法測定水中糞大腸菌群（耐熱大腸菌群）的比較[J].四川環(huán)境，2014，33（2）：82.

[2]趙春霞，張哲海.等酶底物法監(jiān)測環(huán)境水樣大腸菌群的探討[J].中國環(huán)境科學學術(shù)年會論文集，2009.

[3]趙春霞，張哲海.固定底物酶底物法與多管發(fā)酵法和紙片法監(jiān)測環(huán)境水樣大腸菌群的比較[J].環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù)，2009，21（2）：31-32.

收稿日期：2017-05-12

作者簡介：傅德瑜，女，2004年畢業(yè)于西南石油大學，環(huán)境工程專業(yè)工程師，研究方向為環(huán)境監(jiān)測。