不同提取方法對牛乳脂肪分析的影響

楊昕艷

（秦皇島金海特種食用油工業(yè)有限公司，河北秦皇島066000）

不同提取方法對牛乳脂肪分析的影響

楊昕艷

（秦皇島金海特種食用油工業(yè)有限公司，河北秦皇島066000）

分別采用石油醚-乙醚溶劑系統(tǒng)和氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)，并結(jié)合凍干后提取和液液萃取等方法，對牛乳乳脂的總脂肪酸和乳脂脂肪sn-2脂肪酸的組成進行分析。結(jié)果表明，在分析乳脂的脂肪酸組成方面，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)比石油醚-乙醚溶劑系統(tǒng)具有更好的提取效果，尤其對于長鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸；液液萃取比凍干后提取具有更好的平行性和穩(wěn)定性。

乳脂肪；脂肪酸；sn-2脂肪酸；分析；提取方法

脂肪的提取，通常涉及到溶劑的選擇性萃取和被提取對象在脂肪提取之前的處理。脂肪的溶解性是脂肪提取的一個重要標(biāo)準(zhǔn)，其在很大程度上取決于樣品中脂肪的存在類型和非極性脂肪（主要是甘油三酯）與極性脂肪（主要是磷脂和糖脂）所占的比例[1]。因此，可以根據(jù)樣品類型及其組成成分的特點，選擇不同的溶劑系統(tǒng)來提取脂肪組分。

此外，為了從樣品中提取出脂肪，往往需要對樣品進行前處理，以方便脂肪的提取，如干燥、減小樣品的粒徑、破壞包被脂肪的成分等。就乳脂肪來說，在脂肪提取之前需要使用氨水對乳樣進行處理，以溶解酪蛋白，使乳脂肪從包被的基質(zhì)（乳脂肪球膜、酪蛋白膠束）中釋放出來[2-3]。此外，有時還需要對樣品進行預(yù)干燥，以便更高效、更完全地提取脂肪。

脂肪的類型、脂肪酸組成、脂肪結(jié)構(gòu)的組成、脂類物質(zhì)的氧化狀況等的分析，都需要將脂肪從所處的基質(zhì)中分離出來。就脂肪的脂肪酸組成來說，不僅需要了解總脂肪的脂肪酸組成，也需要了解這些脂肪酸在脂肪結(jié)構(gòu)中所處的位置，如sn-2脂肪酸組成等。

脂肪提取的結(jié)果將直接影響脂肪各個屬性的分析。鑒于此，試驗對氯仿-甲醇和石油醚-乙醚2個溶劑系統(tǒng)分別在凍干后提取和液液萃取時，對提取總脂肪的脂肪酸和脂肪結(jié)構(gòu)中sn-2脂肪酸的影響進行了對比。

1 試驗方法

1.1 石油醚-乙醚凍干提取

稱取25 g樣品，進行冷凍干燥。凍干后的樣品加入25 mL乙醇和100 mL石油醚-乙醚（1∶1，V/V）并攪拌均勻（500 r/min，10 min，室溫），然后靜置待溶液澄清，分離出上清液；重復(fù)提取5次后，將所有上清液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心3 min，再將上清液于40℃，100 r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑；將所得乳脂貯藏于-18℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 石油醚-乙醚液液萃取

稱取25 g樣品，加入5 mL氨水和25 mL無水乙醇并搖勻；加入62.5 mL無水乙醚和62.5 mL石油醚，混合均勻后靜置分層，下層液體用75 mL石油醚-乙醚（1∶1，V/V）重復(fù)萃取5次；將所有上清液合并，于40℃，100 r/min條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑；將所得乳脂貯藏于-18℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 氯仿-甲醇液液萃取

稱取10 g樣品，加入2 mL濃氨水，振蕩搖勻后加入30 mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）和適量NaCl，再次振蕩搖勻；以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心5 min，上層液體重復(fù)提取2次；合并所有提取的下層清液，加入適量超純水并振蕩搖勻，離心后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑；將所得乳脂貯藏于-18℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 氯仿-甲醇凍干提取

稱取10 g樣品，加入2 mL濃氨水并振蕩搖勻1 min；將樣品進行冷凍干燥，在凍干后樣品中加入30 mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）和少許NaCl，振蕩搖勻；以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心5 min，取出下層清液后再次加入氯仿-甲醇溶液重復(fù)提取2次；合并所有提取液，后續(xù)處理方法同氯仿-甲醇液液萃取。

1.5 乳脂脂肪酸組成分析

稱取0.3 g乳脂于15 mL樣品瓶中，加入5 mL正己烷和0.5 mol/mL的KOH-CH3OH溶液3 mL；加蓋混勻后置于60℃烘箱加熱0.5 h，取出后立即以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心5 min后，取上清液用Agilent 7820型GC進行分析。氣相色譜升溫程序：140℃保持5 min，以10℃/min升溫至180℃并保持10 min，以2℃/min升溫至210℃并保持10 min，最后以10℃/min升溫至230℃并保持15 min。氣相色譜柱Agilent CP-SIL88型（100 m×0.25 mm×0.2 μm），37種脂肪酸甲酯（Supelco，CRM47885 LC08286V）。

1.6 乳脂sn-2脂肪酸組成分析

（1）樣品處理。取約0.1 g樣品在15 mL離心管中，加入200 μL正己烷使樣品完全溶解；稱取0.02 g豬胰脂肪酶，加入2 mL的Tris緩沖溶液輕輕搖動，加入500 μL膽酸鈉，200 μL飽和CaCl2溶液，在40℃水浴鍋中振搖2 min；然后于室溫下手搖1 min，立即加入1 mL鹽酸及1 mL無水乙醚，劇烈搖勻；以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心3 min，靜置1 min；將上清液加入1支干凈的15 mL離心管中，加入無水硫酸鈉搖勻。

（2）TLC分離。取一塊100 mm×200 mm硅膠板（青島海洋化工GF254），用展開劑（正己烷∶無水乙醚∶乙酸乙酯∶甲酸=60∶38∶2∶1）進行分離；在256 nm的紫外燈下熒光顯色，刮下目標(biāo)區(qū)域，裝入15 mL離心管中；離心管中加1 mL正己烷和1 mL BF3-甲醇溶液，放入60～70℃烘箱中酯化30 min，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心，取上層清液檢測。

檢測方法如乳脂的脂肪酸組成分析所述。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶劑系統(tǒng)和提取方法分析的乳脂脂肪酸組成差異

不同溶劑系統(tǒng)和提取方法對乳脂脂肪酸組成的分析結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑系統(tǒng)和提取方法對乳脂脂肪酸組成的分析結(jié)果

對于石油醚-乙醚溶劑系統(tǒng)來說，無論是凍干提取還是液液萃取，二者提取的乳脂脂肪酸組成具有接近的脂肪酸組成，說明2種提取方法的準(zhǔn)確性較好。在測量數(shù)據(jù)平行性方面，除了飽和脂肪酸C14∶0和C16∶0含量在液液萃取條件下的波動大于凍干提取方法外，其余各種類型脂肪酸測定的平行性方面液液萃取方法優(yōu)于凍干提取方法（具有較小的標(biāo)準(zhǔn)差）。

對于氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)來說，凍干提取方法得到的結(jié)果平行性和穩(wěn)定性明顯比液液萃取方法的差，凍干提取的標(biāo)準(zhǔn)差曲線波動特別大，有些甚至超過9%。

氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)液液萃取與石油醚-乙醚溶劑系統(tǒng)相比而言，其分析結(jié)果也比較接近，同時也具有較好的數(shù)據(jù)平行性，但二者沒有顯著的差異性。

2.2 不同溶劑系統(tǒng)和提取方法分析的乳脂sn-2脂肪酸組成差異

不同溶劑系統(tǒng)和提取方法對乳脂sn-2脂肪酸組成的分析結(jié)果見表2。

表2 不同溶劑系統(tǒng)和提取方法對乳脂sn-2脂肪酸組成的分析結(jié)果

由表2可知，試驗中的同一溶劑系統(tǒng)無論采用凍干提取還是液液萃取，方法之間的差異性很小，結(jié)果極為接近，并且這些方法檢測結(jié)果的重現(xiàn)性也較好，標(biāo)準(zhǔn)差都較低。對于不同溶劑系統(tǒng)，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)平行樣本間的標(biāo)準(zhǔn)差基本在0.7以內(nèi)，顯示出良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。同時，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)進行液液萃取方法獲得的檢測結(jié)果平行性和穩(wěn)定性也更優(yōu)于凍干方法的結(jié)果；石油醚-乙醚溶劑系統(tǒng)中凍干提取方法和液液萃取方法的標(biāo)準(zhǔn)差基本在0.5以上，波動最大的在2左右。因此，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)的效果更優(yōu)于石油醚-乙醚溶劑系統(tǒng)對乳脂sn-2脂肪酸的分析。

對于中短鏈脂肪酸（C8∶0，C10∶0，C12∶0，C14∶0），不同溶劑系統(tǒng)和提取方法之間都有較好的提取效果；而對于長鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸（C16∶0，C18∶1，C18∶0），氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)明顯優(yōu)于石油醚-乙醚系統(tǒng)。由表2可知，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)提取到不飽和脂肪酸C18∶1的相對百分含量大于石油醚-乙醚溶劑系統(tǒng)。因為在乳脂脂肪的sn-2位置，不飽和脂肪酸含量相對較少，因此石油醚-乙醚溶劑系統(tǒng)帶來的結(jié)果誤差大于氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)的結(jié)果誤差。對于不同乳脂來說，尤其是駱駝乳、人乳等，長鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸含量較多的乳類，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)比石油醚-乙醚溶劑系統(tǒng)具有更好的提取效果。

3 結(jié)語

作為脂肪提取常用的溶劑系統(tǒng)，其對總脂肪的提取都具有良好的效果，均在脂肪的分析中得到廣泛應(yīng)用。在試驗中，2種溶劑系統(tǒng)對總脂肪酸的分析結(jié)果相近，沒有顯著性差異，說明這2種溶劑系統(tǒng)都比較適合總脂肪酸組成的分析。然而，對于脂肪結(jié)構(gòu)sn-2位脂肪酸組成的分析中，2種溶劑系統(tǒng)表現(xiàn)出了明顯的不同，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)比石油醚-乙醚溶劑系統(tǒng)在sn-2位脂肪酸分析中具有更好的效果。同時，氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)以液液萃取分析sn-2位脂肪酸結(jié)果也比以凍干后分析sn-2位脂肪酸具有更好的平行性和穩(wěn)定性。

[1]商允鵬，生慶海，王貞瑜，等.三酰甘油sn-2位上棕櫚酸生理功能及研究概況[J].中國糧油學(xué)報，2010（10）：119-123.

[2]袁小武，鄧澤元，李靜，等.胰脂肪酶法測定食用油甘油三酯中脂肪酸的位置分布[J].食品科學(xué)，2008（11）：544-547.

[3]朱啟思，唐家毅，周珞，等.豬油酸解制備人乳脂替代品的研究[J].中國油脂，2009（2）：39-42.◇

Analysis and Evaluation on Fatty Acids and sn-2 Fatty Acids in Commercial Infant Formula

YANG Xinyan
（Qinhuangdao Goldensea Speciality Oils&Fats Industries Co.，Ltd.，Qinhuangdao，Hebei 066000，China）

The total fat and the compositon of cholesterol fat sn-2 fatty acid are analyzed by petroleum ether-ether solvent system and chloroform-methanol solvent system respectively，and the effects of freeze-drying and direct liquid-liquid extraction are studied.The results show that the chloroform-methanol solvent system had better extraction effect than petroleum ether-ether solvent system in the analysis of fatty acid compositon of milk fat.Especially for long-chain fatty acids and unsaturated fatty acids；liquid-liquid extraction is better than freeze-drying the result of parallelism and stability.

milk fat；fatty acids；sn-2 fatty acids；analysis；extraction method

TS816.5

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.032

1671-9646（2017）05b-0015-03

2017-05-26

楊昕艷（1980—），女，本科，工程師，研究方向為食品科學(xué)、油脂化學(xué)和乳品科學(xué)。