黃芪甲苷對大鼠骨骺干細(xì)胞增殖及生物學(xué)特性的影響

姜志洲董黎強(qiáng)尹 航

黃芪甲苷對大鼠骨骺干細(xì)胞增殖及生物學(xué)特性的影響

姜志洲1董黎強(qiáng)2尹 航1

目的探究黃芪甲苷對大鼠骨骺干細(xì)胞（PSCs）增殖及生物學(xué)特性的影響。方法將新生SD大鼠離體培養(yǎng)獲取大鼠骨骺干細(xì)胞，選擇黃芪甲苷對第3代骨骺干細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)誘導(dǎo)，體外培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況、記錄細(xì)胞貼壁情況及時間、細(xì)胞形態(tài)變化及增殖情況。采用免疫組化Ⅱ型膠原單克隆抗體染色方法，檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞的生物學(xué)特性，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。結(jié)果經(jīng)黃芪甲苷干預(yù)誘導(dǎo)后，與對照組比較，實驗組細(xì)胞增殖倍增時間加快（23.20h比30.17h，P<0.05）。第4天、第6天實驗組PSCs細(xì)胞增殖活性較對照組顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[第4天：（0.493±0.138）比（0.420±0.051），第6天：（0.612±0.151）比（0.517±0.153），P<0.05）]，實驗組Ⅱ型膠原單克隆抗體染色表達(dá)陽性優(yōu)于對照組。結(jié)論黃芪甲苷具有促進(jìn)骨骺干細(xì)胞增殖的作用。經(jīng)黃芪甲苷誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨骺干細(xì)胞可以正常地分泌特征性基質(zhì)，并保持骨骺干細(xì)胞的生物學(xué)特性。

大鼠；骨骺干細(xì)胞；黃芪甲苷；成纖維細(xì)胞生長因子-3

在兒童及青少年生長發(fā)育過程中，骨生長發(fā)育占據(jù)著十分重要的地位。骨骺中軟骨細(xì)胞的增殖與分化決定了骨骺板的高度和骨的長度。由于軟骨修復(fù)的能力有限，一旦造成骨骺損傷，就有可能影響骨及骨關(guān)節(jié)發(fā)育或出現(xiàn)畸形，從而影響兒童的骨骼發(fā)育[1]。骨骺干細(xì)胞（precartilaginous stem cells，PSCs）是存在于胚胎或新生動物四肢干骺端LaCroix環(huán)中及長骨干骺端靜止區(qū)的一種成體干細(xì)胞，其在體外有持續(xù)增殖及定向分化的能力[2]。PSCs的分離和培養(yǎng)對未來臨床治療骨骺損傷和修復(fù)軟骨的缺損和退化有重要意義。

但是分離出PSCs的來源非常有限，如何促進(jìn)PSCs的增殖及分化，并使其保持良好的生物學(xué)特性，尤為重要。目前證實中藥黃芪對軟骨細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用及延緩軟骨細(xì)胞退變的作用[3]。黃芪甲苷是從黃芪中提取的主要有效成分，研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷具有促進(jìn)骨髓干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用。本實驗研究黃芪甲苷對體外培養(yǎng)的PSCs的作用，探討對其增殖及生物學(xué)特性的影響。

1 材料與儀器

1.1 主要試劑DMEM/F-12（Invitrogen公司，美國），胎牛血清（Gibco公司，美國），0.25%胰蛋白酶-0.53mmol EDTA（Invitrogen公司，美國），Rabbit Anti-FGFR-3（Santa-cruz公司，美國），Goat antirabbit IgGHRP（福州邁新生物技術(shù)有限公司），內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑（福州邁新生物技術(shù)有限公司），DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司），黃芪注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，10mL×6支，每支相當(dāng)于原藥材20g）。

1.2 主要儀器倒置相差熒光顯微鏡（BM-1000，南京江南永新光學(xué)有限公司），凈化工作臺（SW-CF-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（3111，Thermo公司，美國），電熱恒溫培養(yǎng)箱（HZQF160，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），ELX-800UV酶標(biāo)檢測儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.3 實驗動物健康新生24h的清潔級SD大鼠，不限雌雄，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK（滬）2008－0016。

2 方法

2.1 PSCs的取材、分離培養(yǎng)及鑒定借鑒尹航等[2]制備方法分離培養(yǎng)及鑒定出所需PSCs。

2.2 分組及干預(yù)將傳代培養(yǎng)所得第3代并鑒定成功后的PSCs懸液，以每孔以1×104個細(xì)胞接種于2塊24孔培養(yǎng)板上。隨機(jī)分成對照組和實驗組。在實驗組中加入黃芪甲苷100μg/mL，3mL/d，對照組中加入無藥培養(yǎng)液3mL/d。在之后的8天里，每間隔24h，分別從對照組和實驗組中各取3孔，用0.25wt%胰蛋白酶進(jìn)行充分消化，并在倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)。在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長情況、記錄細(xì)胞貼壁情況及時間、細(xì)胞形態(tài)變化及增殖情況。取均數(shù)繪制生長曲線圖，按照如下公式[1og2/（1ogN1-logN0）] ×t[6]計算細(xì)胞群體倍增時間，其中N0代表接種時間、N1代表培養(yǎng)t小時后的細(xì)胞數(shù)。

2.3 MTT法檢測PSCs增殖情況將誘導(dǎo)后的傳代細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔l×104個細(xì)胞。分別在加入藥液后第2天、4天、6天的時間點，用MTT法檢測實驗組和對照組PSCs的存活和增殖變化情況。在ELX-800UV酶標(biāo)檢測儀上以調(diào)零孔調(diào)零，在光波=490nm時測定各孔的吸光值（OD值）。記錄實驗數(shù)據(jù)。

2.4 PSCs的特性檢測Ⅱ型膠原單克隆抗體染色，待誘導(dǎo)后的細(xì)胞在蓋玻片上生長達(dá)到80%左右時，用4%多聚甲醛固定，在4℃培養(yǎng)過夜，用PBS溶液沖洗2～3次，每次約5min。在室溫下Triton-100+ 0.5%BSA（胎牛蛋白）孵育30min后，用PBS溶液沖洗2～3次，每次約5min。兔抗鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體4℃培養(yǎng)過夜，用PBS溶液沖洗2～3次，每次約5min。FITC標(biāo)記的二抗在室溫條件下孵育30min后，用PBS溶液沖洗2～3次，每次約5min。在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以表示，采用t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪甲苷對PSCs生物學(xué)作用的影響在接種之后的8天里，每間隔24h時間點用倒置顯微鏡分別觀察實驗組和對照組的細(xì)胞生長增殖情況（圖1～ 6，封二），在6～7h后對照組PSCs基本完成細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)較飽滿，呈上皮樣細(xì)胞排列生長，散狀分布生長，細(xì)胞重疊生長很少見。而實驗組細(xì)胞增殖分化速度顯著加快，細(xì)胞貼壁所需完成時間在4～6h左右，對照組細(xì)胞群體倍增時間為30.17h，實驗組為23.20h，兩組比較，P<0.05。細(xì)胞增殖分裂的高峰出現(xiàn)在第6天，之后開始形成平臺期，分裂指數(shù)為35%，顯微鏡下觀察兩組的細(xì)胞形態(tài)變化基本類似。兩組PSCs生長曲線見圖7。

圖7 黃芪甲苷對PSCs生長曲線的影響

3.2 MTT法檢測黃芪甲苷對PSCs增殖活性的影響對照組和實驗組的PSCs增殖活性，在第2天差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），在第4、6天時間點，實驗組較對照組增殖活性顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 黃芪甲苷對PSCs細(xì)胞增殖活性的影響

表1 黃芪甲苷對PSCs細(xì)胞增殖活性的影響

注：與對照組比較，△P<0.05；PSCs：骨骺干細(xì)胞

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3.3 PSCs的生物學(xué)特性檢測實驗組和對照組的PSCsⅡ型膠原單克隆抗體染色表達(dá)均呈陽性。實驗組陽性表達(dá)強(qiáng)于對照組。見圖8～9（封二）。

4 討論

目前治療修復(fù)骨骺損傷，僅僅單純的保守復(fù)位外固定的治療方法達(dá)不到解剖復(fù)位的要求，而內(nèi)固定治療也存在繼發(fā)性骺生長板損傷或固定不可靠的相關(guān)問題，最終的治療效果也不是很理想[6]。胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及脂肪源干細(xì)胞這三大類細(xì)胞是目前研究關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的主要的理想種子[7]，而現(xiàn)下的研究熱點PSCs由于自身的優(yōu)勢，也入選并成為未來軟骨自我再生修復(fù)的理想種子細(xì)胞。

體外培養(yǎng)PSCs所面臨的問題是如何使PSCs更好地調(diào)控并使其保持正常的生物學(xué)特性。目前中醫(yī)藥在組織工程學(xué)方面的應(yīng)用研究越來越廣泛，在常用的中藥中尋找到能夠促進(jìn)PSCs的體外培養(yǎng)，并保持正常的生物學(xué)特性的藥物，為PSCs進(jìn)一步的研究發(fā)展開拓了新道路。

《本草綱目》記載：黃芪“耆，長也。黃耆色黃，為補(bǔ)藥之長，故名?！敝兴廃S芪歸肺、脾、肝、腎經(jīng)，以補(bǔ)氣之長，也有保護(hù)腎臟的功用[8]；而傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為腎主骨，因此黃芪也是補(bǔ)腎強(qiáng)筋健骨的佳藥[9]，具有修復(fù)軟骨及骺板損傷的潛力。藥理研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，中藥黃芪是取自豆科植物膜莢黃芪和蒙古黃芪的干燥根部，含有多糖、皂苷、生物堿、氨基酸、多種礦物質(zhì)及維生素等化學(xué)成分。其中黃芪甲苷是最主要的活性指標(biāo)成分，其藥理作用主要有[12-13]：（1）增強(qiáng)機(jī)體免疫力及抵抗疾病的能力。（2）抗病毒作用。（3）抗應(yīng)激功效。（4）作為促生長劑。（5）改善心肺功能。

劉維統(tǒng)等[3]證實，適當(dāng)濃度的黃芪甲苷具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖作用，并保持軟骨細(xì)胞的活性。王倩等[14]研究證實，中藥黃芪對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用，且維持其遺傳物質(zhì)染色體的穩(wěn)定性。PSCs作為軟骨細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的中間過渡形式，黃芪是否也對體外培養(yǎng)的PSCs也有促進(jìn)作用？本實驗驗證黃芪甲苷對PSCs增殖活性的影響作用，并測定其是否保持PSCs正常的生物學(xué)特性。

在本實驗中將PSCs分泌的特征性基質(zhì)Ⅱ型膠原和蛋白聚糖作為驗證生物學(xué)特性的標(biāo)志物。實驗結(jié)果表明，顯微鏡下觀察兩組的細(xì)胞形態(tài)變化基本類似，但實驗組細(xì)胞增殖分化速度顯著加快，貼壁所需的時間較對照組縮短，說明黃芪甲苷能夠明顯加快PSCs的增殖速度。同時，用MTT法來檢測PSCs的增殖活性，實驗組PSCs的Ⅱ型膠原單克隆抗體染色均呈陽性[15]，表明黃芪甲苷對PSCs誘導(dǎo)后，能夠促進(jìn)PSCs的增殖并能保持正常的生物學(xué)特性。黃芪甲苷促進(jìn)PSCs的增殖，其機(jī)制可能與黃芪的促生長作用與其它因子共同調(diào)控增殖分化相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)。研究[16]認(rèn)為，干細(xì)胞具備先天之精的屬性,是先天之精在細(xì)胞層次的存在形式，而黃芪的補(bǔ)氣化血生髓作用，也為黃芪甲苷能夠促進(jìn)PSCs提供了相關(guān)理論依據(jù)。但是目前仍存在PSCs相關(guān)未解決的難題：（1）黃芪甲苷是通過何種具體途徑及方式來影響調(diào)控PSCs的增殖生長？（2）黃芪甲苷誘導(dǎo)PSCs是否存在增殖分化過度的異常性？都需要進(jìn)一步研究解決。

綜上所述，黃芪甲苷具有促進(jìn)PSCs增殖的作用。經(jīng)黃芪甲苷誘導(dǎo)培養(yǎng)的PSCs可以正常地分泌特征性基質(zhì)，并保持PSCs的生物學(xué)特性。該結(jié)果為今后進(jìn)一步的PSCs體外誘導(dǎo)實驗提供相關(guān)參考依據(jù)。

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黃芪甲苷對大鼠骨骺干細(xì)胞增殖及生物學(xué)特性的影響

圖1 倒置顯微鏡下對照組骨骺干細(xì)胞培養(yǎng)24h后（伊100）

圖2 倒置顯微鏡下實驗組骨骺干細(xì)胞培養(yǎng)24h后（伊100）

圖3 倒置顯微鏡下對照組骨骺干細(xì)胞培養(yǎng)4天后（伊100）

圖5 倒置顯微鏡下對照組骨骺干細(xì)胞培養(yǎng)6天后（伊100）

圖6 倒置顯微鏡下實驗組骨骺干細(xì)胞培養(yǎng)6天后（伊100）

圖8 倒置顯微鏡下對照組骨骺干細(xì)胞域型膠原單克隆抗體染色呈陽（域型膠原單克隆抗體染色伊100）

圖9 倒置顯微鏡下實驗組骨骺干細(xì)胞域型膠原單克隆抗體染色呈強(qiáng)陽性（域型膠原單克隆抗體染色伊100）

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（收稿：2016-08-09修回：2016-12-19）

Effect of Astragalosideon Proliferation and Biological Characteristics of Precartilaginous Stem Cells of Rats

JIANG Zhizhou1,DONG liqiang2,YIN hang1.1 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China; 2 Department of Orthopedics,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310005),China

ObjectiveTo investigate the effect of astragaloside on proliferation and biological characteristics of precartilaginous stem cellsin Rats.MethodsPrecartilaginous stem cellswere obtained fromnewborn SD rats and cultured in vitro,then the third generation precartilaginous stem cells were chosen to co-cultured with astragaloside.The growth of cells was observed by inverted microscope and the adhere time,circumstances,morphologic changes and proliferationof cells were recorded.Cell biological characteristics induced by astragaloside was tested with immunohisto chemistry Collagen typeⅡmonoclonal antibody staining,the activity of cells was detected by MMT assay.ResultsThe speed of cell proliferation accelerated in experiment group,with a population doubling time of 23.20 h compared to 30.17 h of control group（P<0.05）.On Day 4 and Day 6,the cells in experiment group showed higher activity than those in control group,with a significant difference（Day 4:0.493±0.138 vs 0.420±0.051;Day 6:0.612±0.151 vs 0.517±0.153;all P<0.05）.Collagen typeⅡmonoclonal antibody staining in experiment group and control group were both positive,but the staining was more obvious in experiment group.ConclusionAstragaloside can promote the growth of precartilaginous stem cells.Precartilaginous stem cells which was induced with astragaloside can normallysecrete characteristic matrix and keep the well biological characteristics of precartilaginous stem cells.

rats;precartilaginous stem cells;astragaloside;fibroblast growth factor receptor 3

浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級科研基金重點項目（No.20102202）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州310053）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科（杭州310005）

尹航，Tel：13675894037；E-mail：feidao95@126.com