大鼠SNI神經(jīng)痛模型不同時相脊髓背角p-p38MAPK和p-ATF2表達的變化

何曉芬蔣永亮葉佳瑜顏思思杜俊英陳利芳趙文勝方劍喬陳曉軍

大鼠SNI神經(jīng)痛模型不同時相脊髓背角p-p38MAPK和p-ATF2表達的變化

何曉芬1，2蔣永亮1，2葉佳瑜1顏思思1杜俊英1，2陳利芳2趙文勝3方劍喬1，2陳曉軍2

目的觀察坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（SNI）模型大鼠不同時間點術(shù)側(cè)腰段L4～L6脊髓背角神經(jīng)元磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（p-p38MAPK）和磷酸化活化轉(zhuǎn)錄因子2（p-ATF2）的表達情況，探討脊髓背角p-p38MAPK和p-ATF2在神經(jīng)病理性痛模型不同階段中的作用。方法健康雄性SD大鼠36只，完全隨機分為空白對照組、假手術(shù)組和手術(shù)組，各12只。通過結(jié)扎腓總神經(jīng)及切斷脛神經(jīng)，保留腓腸神經(jīng)的方法建立SNI大鼠模型。觀察造模前、造模后3天和14天術(shù)側(cè)足跖縮足閾值（PWT）；免疫熒光法檢測造模后3天和14天術(shù)側(cè)腰段脊髓背角p-p38MAPK和p-ATF2陽性細胞表達情況。結(jié)果選模后3天和14天，手術(shù)組大鼠術(shù)側(cè)足跖PWT較假手術(shù)組與空白對照組明顯降低（P<0.01），假手術(shù)組大鼠與空白對照組大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。造模后3天和14天，手術(shù)組大鼠術(shù)側(cè)腰段脊髓背角p-p38MAPK和p-ATF2陽性細胞表達率較假手術(shù)組和空白對照組均明顯升高（P<0.01），假手術(shù)組和空白對照組SNI模型大鼠造模后各時間點，術(shù)側(cè)腰段脊髓背角p-p38MAPK和p-ATF2陽性細胞表達率差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論SNI模型神經(jīng)病理痛的產(chǎn)生和維持可能與術(shù)側(cè)腰段脊髓背角p-p38MAPK和p-ATF2表達上調(diào)有關。

大鼠；神經(jīng)病理痛；坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型；脊髓背角；p-p38MAPK；p-ATF2

KEY WORDSrats;neuropathic pain;spared nerve injury;spinal cord dorsal horn;p-p38MAPK;p-ATF2

神經(jīng)病理痛，如中風后遺痛、皰疹后遺痛、三叉神經(jīng)痛等，是臨床上常見、多發(fā)又難治的慢性疼痛疾病，發(fā)病機制遠未明確[1-2]，目前臨床治療仍以抗抑郁、抗驚厥和阿片類藥物為主，這些藥物存在著缺乏針對性以及長期使用伴有嚴重毒副作用等問題[3]。進一步闡明神經(jīng)病理痛的發(fā)病機制是當前疼痛研究領域的一個熱點。神經(jīng)病理痛主要病理表現(xiàn)為痛敏化，如自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏[4-5]。中樞敏化是神經(jīng)病理痛發(fā)生、維持的關鍵機制之一[3，6-7]，主要涉及脊髓背角（spinal cord dorsal horn，SCDH）神經(jīng)元的超興奮性。脊髓背角神經(jīng)元p38絲裂原活化蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）的活化在神經(jīng)病理痛的中樞敏化中起著重要作用[8-10]。研究[11]表明，轉(zhuǎn)錄因子2（activating transcription factor 2，ATF2）的活化參與神經(jīng)病理痛的調(diào)節(jié)。p38MAPK和ATF2的活化在神經(jīng)病理痛過程中均起著重要作用，但在神經(jīng)病理痛產(chǎn)生與維持的不同階段，關于脊髓背角神經(jīng)元p38MAPK和ATF2活化情況，目前尚缺少系統(tǒng)研究。

本實驗通過建立坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（spared nerve injury，SNI）大鼠模型，通過觀察SNI神經(jīng)痛大鼠早期與維持期腰段脊髓背角磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）和磷酸化ATF2（p-ATF2）的表達情況，明確p38MAPK和ATF2在神經(jīng)病理痛模型中產(chǎn)生與維持的不同階段的活化情況，為找尋神經(jīng)痛不同時期更具有針對性的疼痛治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用健康清潔級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量（180±20）g，購自中國科學院上海實驗動物中心，實驗動物合格證：SCXK（滬）2013-0016，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心[合格證號：SYXK（浙）20 13-0184]飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予標準飼料及自由飲水，12h黑白循環(huán)燈光，恒定溫度和濕度。本實驗所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

1.2 主要儀器和試劑儀器：0.25mm×13mm華佗牌無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）、HANS-200A穴位神經(jīng)刺激儀（聯(lián)創(chuàng)科技南京濟生醫(yī)療科技有限公司）、動態(tài)足底測量儀（意大利UGO Basile公司）、冰凍切片機（美國Thermo公司）、激光共聚焦顯微鏡（日本Nikon公司）。試劑：兔抗大鼠p-p38MAPK抗體（美國Cell Signaling公司）、兔抗大鼠p-ATF2多克隆抗體（美國Cell Signaling公司）。

1.3 分組與造模采用完全隨機法將大鼠隨機分為空白對照組、假手術(shù)組與手術(shù)組，各12只。手術(shù)組：將SD大鼠用10%水合氯醛（0.35mL/100g）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，充分暴露右側(cè)臀區(qū)，剃毛消毒，在大鼠股骨中點下約0.5cm處平行坐骨神經(jīng)大鼠方向剪開皮膚，鈍性分離臀部肌肉、股二頭肌，暴露坐骨神經(jīng)干，玻璃分針分離周圍粘連組織，分離出坐骨神經(jīng)的3個分支：脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng)，用5.0絲線把脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)緊緊結(jié)扎，在靠近結(jié)扎的遠側(cè)端并且距離神經(jīng)干遠側(cè)端大約2～ 4mm處切斷；保持腓腸神經(jīng)完整，然后分層縫合肌肉和皮膚。肌注青霉素4～5U以預防感染。單籠飼養(yǎng)1天后用于實驗。假手術(shù)組：大鼠僅暴露神經(jīng)，不結(jié)扎和切斷，其余方法同手術(shù)組。空白對照組：大鼠不做任何處理。

1.4 機械痛檢測采用動態(tài)足底測量儀檢測大鼠術(shù)側(cè)縮足閾值（paw withdrawal threshold，PWT），作為大鼠機械性痛覺超敏的評價指標。測量前，各組大鼠適應環(huán)境2天；將大鼠置于鐵絲網(wǎng)上的透明有機玻璃箱內(nèi)（20cm×20cm×15cm），足部暴露于鐵絲網(wǎng)眼中，安靜后（即停止梳理毛發(fā)和探索性活動，15～20min），將類似Von Frey絲的金屬絲（直徑0.5mm）置于大鼠足底外側(cè)（腓腸神經(jīng)的支配區(qū)域），刺激力量從0g開始以2.5g/s遞增，直至大鼠產(chǎn)生縮腿反應；此時電子記錄器會自動記錄下大鼠逃避時所接受的刺激力量，此力量數(shù)值即為大鼠PWT。最大刺激力量為50g，避免大鼠足爪損傷；連續(xù)測量3次，間隔5min，取平均值。每組選取8只大鼠，分別于造模前及造模后第3天、第14天測量PWT。

1.5 免疫熒光法檢測脊髓背角p-p38MAPK和p-ATF2陽性細胞表達

1.5.1 樣本處理每組選取3只大鼠，分別于造模后3天和14天分批處死大鼠：以10%水合氯醛以3.5mL/kg的劑量腹腔注射麻醉，小心解剖胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室升主動脈予生理鹽水（4℃）灌注沖洗，再用4%多聚甲醛500mL灌注?？焖偃〕龃笫蠡紓?cè)腰段脊髓（即腰膨大），置4%多聚甲醛溶液中后固定4h。依次置于15%、30%蔗糖溶液梯度脫水，經(jīng)液氮速凍后，置入-80℃冰箱保存，用于免疫熒光法的檢測。

1.5.2 免疫熒光法檢測SCDH p-p38MAPK陽性細胞表達取出大鼠脊髓，用OCT包埋后，固定于冰凍切片機的凍頭上，以50μm的厚度修片至所需組織部位，以30μm切取組織待用。采用漂片法染色，具體步驟如下：（1）小心取出切片，TBST漂洗10min× 3次。（2）10%驢血清（TBST稀釋），37℃孵育1h，以增加細胞通透性和封閉非特異性結(jié)合位點，切片勿洗。（3）分別加入p-p38MAPK和p-ATF2的一抗：兔抗大鼠p-p38MAPK單克隆抗體（1:400）、兔抗大鼠p-ATF2多克隆抗體（1:200），4℃孵育過夜，TBST漂洗10min×3次。（4）加入相應的二抗：p-p38MAPK、p-ATF2均加入Alexa Fluor 488驢抗兔IgG（H+L）（1:400），進行免疫熒光標記，37℃孵育（避光）1h，TBST漂洗10min×5次（避光）。（5）撈片：將漂洗干凈的切片轉(zhuǎn)移至處理好的載玻片上，擦干水漬，滴加抗熒光淬滅封片液封片。（6）拍片：共聚焦顯微鏡下觀察并攝取圖片。由Image ProPlus6.0病理圖像分析系統(tǒng)計算陽性細胞率。每組選取3只大鼠，每只大鼠取5張不連續(xù)切片，分別記錄大鼠患側(cè)腰段脊髓背角淺層（Ⅰ～Ⅱ?qū)樱﹥?nèi)p-p38MAPK和p-ATF2陽性像素點和區(qū)域總像素點，并計算其陽性百分率[12-13]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點痛閾變化比較造模前，三組大鼠PWT無顯著差異。造模后3天和14天，與空白對照組比較，假手術(shù)組大鼠術(shù)側(cè)足跖PWT無顯著變化（P>0.05），手術(shù)組大鼠術(shù)側(cè)PWT顯著降低（P< 0.01）；與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠術(shù)側(cè)PWT顯著降低（P<0.01），見圖1。

2.2 各組大鼠腰段脊髓背角p-p38MAPK和p-ATF2陽性細胞表達比較造模后3天和14天，與空白對照組比較，假手術(shù)組大鼠術(shù)側(cè)腰段脊髓背角淺層內(nèi)p-p38MAPK和p-ATF2無顯著變化（P>0.05），手術(shù)組大鼠術(shù)側(cè)腰段脊髓背角淺層內(nèi)p-p38MAPK和p-ATF2顯著升高（P<0.01）；與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠術(shù)側(cè)腰段脊髓背角淺層內(nèi)p-p38MAPK和p-ATF2顯著升高（P<0.01）。見圖2～3（封三）。

3 討論

圖1 各組SNI模型大鼠不同時間點痛閾變化情況（n=8）

圖2 各組SNI模型大鼠造模后3天術(shù)側(cè)L4～L6脊髓背角pp38MAPK和p-ATF2表達情況（n=3）

圖3 各組SNI模型大鼠造模后14天術(shù)側(cè)L4～L6脊髓背角p-p38MAPK和p-ATF2表達情況（n=3）

目前常用的神經(jīng)病理痛動物模型主要包CCI模型[14]、坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎模型[15]、SNL模型[16]、SNI模型[17]4種。SNI模型是相對較新型的外周神經(jīng)損傷導致的長時程神經(jīng)病理痛模型，因其造模方法簡單、重復性高[17]，在基礎研究中得到廣泛應用。在本實驗中，SNI模型大鼠造模后3天機械痛閾明顯下降并伴有舔足、抬腳等自發(fā)性疼痛現(xiàn)象，造模后14天痛閾仍顯著低于空白對照組大鼠（P<0.01），表明神經(jīng)病理痛模型成功建立。

研究[18]發(fā)現(xiàn)，MAPK是信號從細胞表面?zhèn)鲗е良毎藘?nèi)部的重要傳遞者，通過對轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化來調(diào)節(jié)參與細胞反應基因的轉(zhuǎn)錄表達，包括p38MAPK、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）和c-jun氨基末端激酶（c-junN-terminal kinase，JNK）。p38MAPK通過對細胞轉(zhuǎn)錄、蛋白合成和受體表達等的調(diào)節(jié)，在神經(jīng)元的可塑性變化及痛覺信息轉(zhuǎn)導中起重要作用[19]。近年研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角神經(jīng)元p-p38MAPK在神經(jīng)病理痛的中樞敏化的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮著關鍵作用[8]；研究[10]表明，脊神經(jīng)結(jié)扎12h后，p-p38MAPK表達開始增加，在3天達高峰，術(shù)后3周一直維持在一個較高的水平。研究表明鞘內(nèi)注射p38MAPK抑制劑能減輕傷害性行為學變化[20]；脊髓背角是接受外周傷害性信息傳入，并將此信息向上位腦結(jié)構(gòu)傳遞的中繼站，傳遞傷害性信息的細纖維，主要終止于脊髓背角Ⅰ、Ⅱ?qū)覽21]。本結(jié)果顯示，SNI造模后3天、14天，SNI大鼠腰段脊髓背角p-p38MAPK陽性細胞表達均明顯升高。

研究[11]表明，活化的p38MAPK進入細胞核，使ATF2活化后作用于靶基因啟動子，進而參與疼痛的調(diào)節(jié)。已有研究表明，在多種疼痛模型中，脊髓背角p-ATF2水平明顯升高[22]。本實驗免疫熒光結(jié)果顯示，在神經(jīng)病理痛的早期和維持期脊髓背角p-ATF2陽性細胞表達明顯升高。

本研究表明，SNI神經(jīng)痛大鼠早期和維持期的脊髓背角p-p38MAPK和p-ATF2均明顯升高，以上結(jié)果提示SNI神經(jīng)病理痛的發(fā)生、維持均與脊髓背角p38MAPK和ATF2的活化有關。

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（收稿：2016-11-20修回：2016-12-19）

Changes of p-p38MAPK and p-ATF2 Expression in Spinal Cord Dorsal Horn at Different Periods of Spared Nerve Injury Induced Neuropathic Pain in Rats

HE Xiaofen1,2,JIANG Yongliang1,2,YE Jiayu1,YAN Sisi1,DU Junying1,2,CHEN Lifang2,ZHAO Wensheng3,FANG Jianqiao1,2,CHEN Xiaojun2.1 Department of Neurobiology and Acupuncture Research,the Third Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou(310053),China;2 Department of Acupuncture and Moxibustion,the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;3 Department of Pain Treatment,the TCM&WM Hospital of Zhejiang Traditional Chinese Medicine University,Hangzhou(310003),China

ObjectiveTo investigate the changes of p-p38MAPK and p-ATF2 expression in ipsilateral L4-L6 spinal cord dorsal horn（SCDH）of ratsat different times of the spared nerve injury（SNI）,and to probe into the effect of central p-p38MAPK and p-ATF2 in neuropathic pain.MethodsThirty-six healthy male SD rats were randomly divided into control group,sham surgery group and surgery group.The spared nerve injury model was established by ligating the common peroneal and the tibial nerves and then cutting off the nerves but keeping the sural nerve intact. Ipsilateral paw withdrawal threshold（PWT）were measured.The levels of p-p38MAPK and p-ATF2 in ipsilateral SCDH were tested by immunofluorescence.ResultsRats in surgery group developed spontaneous pain and showed a significant reduction in PWT on D3 and D14（P<0.01）,while that of sham surgery did not show a significant reduction（P>0.05）.P-p38MAPK and p-ATF2 expression in ipsilateral L4-L6 SCDH of spared nerve injury rats increased on D3 and D14 after injury（P<0.01,P<0.01）.There was no difference of p-p38MAPK and p-ATF2 expression in ipsilateral L4-L6 SCDH between control group and sham surgery group（P>0.05）.ConclusionThe induction and maintainence of spared nerve injury-induced neuropathic pain were associated with the activation of p-p38MAPK and p-ATF2 in ipsilateral SCDH.

浙江省自然科學基金（No.LY14H270002，No.LY14H270007）；浙江省重點科技創(chuàng)新團隊計劃資助（No.2013TD15）

1浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院針灸神經(jīng)生物學實驗室（杭州310053）；2浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院針灸科（杭州310005）；3浙江中醫(yī)藥大學附屬浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院疼痛科（杭州310003）

陳曉軍，Tel：15967120599；E-mail：cxj1019@sina.com；方劍喬，Tel：0571-86673000；E-mail：fangjianqiao7532@163.com