電針對完全性脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠脊髓組織中Caspase-9、細胞色素C及凋亡蛋白酶激活因子-1表達的影響①

許明，張泓，劉繼生，尹秀婷，張健，黃桂蘭，艾坤

電針對完全性脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠脊髓組織中Caspase-9、細胞色素C及凋亡蛋白酶激活因子-1表達的影響①

許明，張泓，劉繼生，尹秀婷，張健，黃桂蘭，艾坤

目的觀察電針對完全性脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠膀胱功能及脊髓組織中Caspase-9、細胞色素C(Cyt-C)及凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)表達的影響。方法雌性Sprague-Dawley大鼠60只，隨機抽取36只，采用改良T10脊髓橫斷法制作完全性脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱模型，取24只成功模型分為模型組和電針組各12只，其余未造模大鼠24只隨機分為假手術(shù)組和空白組各12只。于造模后第19天取次髎、中極、三陰交、大椎行電針，連續(xù)7 d后行尿流動力學(xué)檢測，TUNEL法測定細胞凋亡率，Western blotting測定脊髓組織中Caspase-9、Cyt-C和Apaf-1蛋白的表達情況。結(jié)果與空白組和假手術(shù)組比較，模型組和電針組膀胱最大容量及膀胱順應(yīng)性均明顯降低(P＜0.01)，膀胱基礎(chǔ)壓力和漏尿點壓力增加(P＜0.05)；脊髓組織TUNEL陽性率顯著升高(P＜0.001)；脊髓組織中Caspase-9、Cyt-C和Apaf-1蛋白表達升高(P＜0.05)。與模型組比較，電針組的膀胱最大容量及膀胱順應(yīng)性明顯增加(P＜0.01)，膀胱基礎(chǔ)壓力和漏尿點壓力降低(P＜0.05)；脊髓組織TUNEL陽性率明顯降低(P＜0.01)；脊髓組織中Caspase-9、Cyt-C及Apaf-1蛋白表達量降低(P＜0.05)。結(jié)論電針次髎、中極、三陰交、大椎可改善完全性脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠膀胱功能，其作用機制可能與脊髓組織中Caspase-9、Cyt-C和Apaf-1的表達下調(diào)，凋亡減少有關(guān)。

脊髓損傷；神經(jīng)源性膀胱；電針；Caspase-9；細胞色素C；凋亡蛋白酶激活因子-1；凋亡；大鼠

[本文著錄格式]許明，張泓，劉繼生，等.電針對完全性脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠脊髓組織中Caspase-9、細胞色素C及凋亡蛋白酶激活因子-1表達的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2017,23(6):628-633.

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神經(jīng)源性膀胱是一類由于神經(jīng)系統(tǒng)病變導(dǎo)致膀胱和尿道功能障礙，進而產(chǎn)生一系列下尿路癥狀的疾病總稱，是脊髓損傷后嚴(yán)重的并發(fā)癥[1]。治療脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的方法很多，其作用機制涉及調(diào)節(jié)膀胱平滑肌功能、改善下尿路神經(jīng)支配等多個方面[2]。近年來大量實驗研究表明[3-4]，線粒體通路在細胞凋亡機制中起著至關(guān)重要的作用，由Caspase-9、細胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)和凋亡蛋白酶激活因子-1 (apoptotic protease activating factor 1,Apaf-1)組成的凋亡小體進一步激活凋亡效應(yīng)蛋白Caspase-3，引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡。

電針治療神經(jīng)源性膀胱的療效顯著。本研究通過觀察電針次髎、中極、三陰交、大椎對骶上完全性脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠膀胱壓力、最大容量、順應(yīng)性改變及脊髓組織Caspase-9、Cyt-C和Apaf-1蛋白表達水平的影響，進一步探討電針治療骶上完全性脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的可能機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與儀器

健康雌性SPF級Sprague-Dawley大鼠60只，許可證號SCXK(湘)2013-0004，體質(zhì)量(220±20)g，飼喂于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心實驗室，使用許可證號SYXK(湘)2013-0005。適應(yīng)1周后進行實驗。實驗過程中對動物處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[5]。

21710-1-AP型Rabbit抗體：美國PROTEINTECH。超敏發(fā)光液：美國THERMO PIERCE。顯影液、定影液：長沙維世爾生物科技有限公司。TUNEL試劑盒，標(biāo)號KGA7045：南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。MP150-WSW多通道生理記錄儀：美國BIOPAC公司。164-5050電泳儀：美國BIO-RAD。DYCZ-40A轉(zhuǎn)膜儀：中國北京六一儀器廠。SDZ-V型華佗牌電針治療儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。

1.2 模型建立及分組

將60只大鼠按照隨機數(shù)字表法選取36只，制作骶上完全性脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱模型[6]：暴露T10節(jié)段脊髓，快速切斷后依次縫合肌肉、筋膜和皮膚；術(shù)后用大籠單籠飼養(yǎng)，定時翻身與清潔護理，Crede手法輔助排尿，防酸堿失衡和電解質(zhì)紊亂，抗感染等對癥治療；觀察造模大鼠雙后肢運動功能狀態(tài)及膀胱情況，雙后肢自主運動或自主排尿、自噬或死亡的大鼠，不納入實驗。

經(jīng)后肢運動功能及膀胱排尿情況評價[6]確定成功的神經(jīng)源性膀胱模型大鼠隨機抽取24只分為模型組(n=12)和電針組(n=12)。其余24只隨機分為假手術(shù)組(n=12)和空白組(n=12)。假手術(shù)組僅暴露脊髓10 min后依次縫合，予抗感染處理；空白組不做特殊處理。

1.3 腧穴與電針方法

電針組參照“十五”國家規(guī)劃統(tǒng)編教材《實驗針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜[7]進行腧穴定位。次髎[8]：第2、3骶骨的棘突間隙正中偏上處旁開5～10 mm，直刺15 mm。中極：腹正中線上，胸鎖聯(lián)合與恥骨聯(lián)合上緣連線的上3/4與下1/4的交點定位為神闕穴，神闕穴與恥骨聯(lián)合上緣連線的上4/5與下1/5的交點為中極穴，斜刺5 mm。三陰交：后肢內(nèi)踝尖直上方1 cm處，直刺5 mm。大椎：背部正中第7頸椎和第1胸椎間，直刺10 mm。將經(jīng)過手法排尿后的大鼠溫和固定于鼠架上，用30號1寸針直刺，進針后接SDZ-V型華佗牌電針治療儀，設(shè)定為疏密波(密波50 Hz，疏波10 Hz)，兩組分別接中極與三陰交、次髎與大椎。刺激強度以肢體輕顫不發(fā)生為度。電針時間20 min，于造模后第19天[6]開始電針干預(yù)，連續(xù)7 d，每天1次。其余三組束縛20 min，不進行電針干預(yù)。

1.4 標(biāo)本采集與處理

各組動物完成尿流動力學(xué)檢測后，以10%水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉，取脊髓T10節(jié)段上下各0.5～1 cm脊髓組織，經(jīng)4℃生理鹽水漂凈，濾紙吸干，一部分脊髓組織-80℃冰箱凍存待用，另一部分經(jīng)10%中性甲醛固定后做石蠟切片。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 尿流動力學(xué)測定

電針干預(yù)7 d后行尿流動力學(xué)檢測，各組平行交替進行，記錄膀胱壓力曲線圖。以10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后，排空大鼠膀胱，經(jīng)尿道輕導(dǎo)入F3導(dǎo)管，以三通管連接MP150-WSW多通道生理記錄儀與微量灌注泵，以0.1 ml/min速率[9]勻速注入溫度為25～35℃的生理鹽水，同步記錄膀胱壓力(1 cmH2O=0.098 kPa)。導(dǎo)尿管進入膀胱的起始壓力為膀胱基礎(chǔ)壓，膀胱最大容量為尿道口首次流出液體時的灌注容積，此時壓力為漏尿點壓力，膀胱順應(yīng)性為膀胱容量的變化與壓力變化的比值。

1.5.2 TUNEL法檢測

各組大鼠脊髓組織石蠟包埋后切片，二甲苯脫蠟2次，100%、95%、80%、75%乙醇水合，每次5 min，浸入3%H2O2封閉液中，室溫(15～25℃)封閉10 min，加熱修復(fù)抗原，冷卻后依次加入TdT酶反應(yīng)液、Streptavidin-FITC標(biāo)記工作液，放入溫盒中，37℃避光反應(yīng)60 min，熒光顯微鏡檢測。POD標(biāo)記后采用DAB顯色，顯色后的樣本片浸入PBS，漂洗3次，每次5 min，用蘇木素復(fù)染后晾干，加中性樹膠和蓋玻片，光鏡下觀察拍照。普通電腦采集照片后，用圖像分析軟件Image-Pro Plus對400倍視野進行分析，取平均數(shù)，細胞凋亡陽性率為視野下計數(shù)的陽性細胞占細胞核總數(shù)的比值。

1.5.3 Western blotting

按RIPA裂解液說明書提取細胞總蛋白，參照BCA蛋白定量試劑盒(WELLBIOLOGY)使用說明操作測定蛋白濃度。取樣與5×loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷。根據(jù)蛋白定量的結(jié)果，每空上樣已變性蛋白5 μl，待溴酚藍電泳至膠底部時終止。分別切膠Caspase-9(36 kD,46 kD)、Cyt-C(14 kD)、Apaf-1(130～142 kD)，β-actin(42 kD)，轉(zhuǎn)至PVDF膜，蓋上儀器，接通電源，轉(zhuǎn)膜300 mA，Caspase-9約70 min、Cyt-C約30 min、Apaf-1約160 min、β-actin約1 h，用5%脫脂奶粉將膜浸入后，室溫放置1 h。將膜與Caspase-9(1∶1000)、Cyt-C(1∶500)、Apaf-1(1∶2000)、β-actin(1∶4000)一抗一起孵育，4℃過夜。用1×TBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗(Proteintech)，稀釋比例1∶3000，將稀釋后的二抗與膜共同孵育45～60 min，1×TBST洗3次，每次15 min。ECL顯色曝光后底片掃描，Quantity One專業(yè)灰度分析軟件分析目的蛋白和內(nèi)參β-actin蛋白的灰度值，以兩者灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行處理。計量資料用(xˉ±s)表示，進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布者，用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett's T3法；不符合正態(tài)分布者，采用秩和檢驗(K Independent Samples)。顯著性水平α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

造模過程中5只大鼠死亡，1只自噬，1只后肢運動功能基本正常，均予剔除。造模后18 d存活有29只大鼠符合模型要求。模型大鼠排尿次數(shù)增多，單次尿量減少，飲食減少，體質(zhì)量下降，空白組與假手術(shù)組無死亡，活動及飲食、排尿、排便等較之前無明顯差別。

2.2 尿流動力學(xué)檢測

與空白組和假手術(shù)組比較，模型組和電針組膀胱最大容量及膀胱順應(yīng)性均明顯降低(P＜0.01)，膀胱基礎(chǔ)壓力和漏尿點壓力增加(P＜0.05)。與模型組比較，電針組的膀胱最大容量及膀胱順應(yīng)性明顯增加(P＜0.01)，膀胱基礎(chǔ)壓力和漏尿點壓力降低(P＜0.05)?？瞻捉M與假手術(shù)組各項無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

2.3 脊髓凋亡情況

TUNEL染色中，核染成棕(黃)色或褐色的細胞為陽性細胞，空白組和假手術(shù)組脊髓組織中可見少量散在陽性細胞，模型組和電針組脊髓組織中陽性細胞較多。見圖1。

空白組與假手術(shù)組的脊髓組織TUNEL陽性率無顯著性差異(P＞0.05)。與空白組和假手術(shù)組比較，模型組和電針組脊髓組織TUNEL陽性率顯著升高(P＜0.001)；與模型組比較，電針組脊髓組織TUNEL陽性率明顯降低(P＜0.01)。見表2。

表1 尿流動力學(xué)檢測結(jié)果

表2 各組大鼠脊髓組織TUNEL陽性率的比較(%)

2.4 Western blotting

與空白組和假手術(shù)組比較，模型組和電針組的Caspase-9、Cyt-C及Apaf-1蛋白表達量增加(P＜0.05)。與模型組比較，電針組Caspase-9、Cyt-C及 Apaf-1蛋白表達量降低(P＜0.05)；空白組與假手術(shù)組的Caspase-9、Cyt-C和Apaf-1蛋白表達量無顯著性差異(P＞0.05)。見表3、圖2。

表3 各組Western blotting檢測結(jié)果

圖2 各組Western blotting檢測結(jié)果

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)認為脊髓損傷屬于“痿證”，神經(jīng)源性膀胱相當(dāng)于“遺溺”“小便不禁”范疇，本研究選擇次髎、中極、三陰交、大椎穴進行電針干預(yù)。從現(xiàn)代解剖及排尿反射神經(jīng)通路來分析，排尿中樞位于骶叢神經(jīng)，而次髎位于第2骶后孔處，內(nèi)有骶神經(jīng)支配膀胱等盆腔臟器，神經(jīng)沖動傳入S1～S3節(jié)段，電針可直接刺激骶神經(jīng)根傳出神經(jīng)，調(diào)節(jié)逼尿肌及膀胱內(nèi)括約肌運動[10]；中極通過自主神經(jīng)刺激傳入神經(jīng)，調(diào)節(jié)膀胱活動，促進其功能恢復(fù)[11]；三陰交下有來自于L4～S3神經(jīng)根的脛神經(jīng)通過，該穴淺層有屬L4神經(jīng)節(jié)段的隱神經(jīng)，深層屬L5、S1神經(jīng)節(jié)段支配[12]，電刺激該穴可通過反射弧傳到脊髓后根，調(diào)節(jié)腰骶部排尿中樞，雙向調(diào)節(jié)膀胱的順應(yīng)性；大椎穴位于脊髓上端。電針在損傷的脊髓處產(chǎn)生一個比較恒定的脈沖電場，保護脊髓神經(jīng)元的功能，從而改善膀胱神經(jīng)支配。

目前臨床對大多數(shù)神經(jīng)源性膀胱患者的主要治療手段仍是保守治療，主要包括膀胱功能訓(xùn)練，電、磁刺激療法以及針灸療法。其中，針灸具有療效確切、操作簡便、成本低廉、無創(chuàng)性、毒副作用小的獨特優(yōu)勢，而電針既具有針刺的治療作用，也具有電刺激效應(yīng)。近年來大量的臨床[13-15]和實驗研究[16-17]也證實電針對脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的療效確切，但是評價療效的標(biāo)準(zhǔn)尚不完全一致。

尿流動力學(xué)檢測是目前對神經(jīng)源性膀胱進行診斷及療效評價的“金標(biāo)準(zhǔn)”，能夠比較準(zhǔn)確地反映膀胱的儲尿及排尿功能，為神經(jīng)源性膀胱的療效提供評價參數(shù)[18-19]。近年來出現(xiàn)不少用尿流動力學(xué)檢測膀胱功能的研究，但電針治療脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的尿流動力學(xué)療效評價很少。本實驗觀察到模型大鼠的膀胱最大容量及膀胱順應(yīng)性比空白組和假手術(shù)組明顯下降，膀胱壓力明顯增加，出現(xiàn)尿頻、尿急、漏尿等尿失禁表現(xiàn)；而電針后大鼠的膀胱最大容量、膀胱壓力及膀胱順應(yīng)性比模型組有改善。說明電針可增加骶上脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠的膀胱最大容量及順應(yīng)性，緩解逼尿肌痙攣，從而降低膀胱壓力，部分解決骶上脊髓損傷患者的下尿路障礙問題。

本實驗中采用10%水合氯醛麻醉大鼠后進行尿流動力學(xué)檢測，通過測定膀胱內(nèi)壓評估大鼠膀胱功能障礙，與通過尿道括約肌肌電信號測量評估方法一樣，其數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性被大多數(shù)研究者認為可能會受到麻醉狀態(tài)的部分影響[20]。但本實驗中各組大鼠的測壓均在麻醉狀態(tài)下測量，因而不影響對電針療效的評估及作用機制的探討，然而如何在實驗大鼠保持清醒的狀態(tài)下測量尿流動力學(xué)參數(shù)仍是目前研究的一個難點。

目前的研究表明，至少有線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑三條通路參與凋亡的發(fā)生[21]，細胞凋亡依次經(jīng)歷凋亡誘導(dǎo)、調(diào)控執(zhí)行和效應(yīng)三個階段。Caspase-9誘導(dǎo)的凋亡主要是線粒體依賴途徑。線粒體外膜釋放的Cyt-C，在ATP/dATP的參與下與Apaf-1結(jié)合，使Apaf-1發(fā)生構(gòu)象改變，繼而寡聚化，并通過Apaf-1氨基端和procaspase-9的功能前區(qū)之間的相互作用，促使Caspase-9前體與Apaf-1氨基端結(jié)合，形成分子量為700～1400 kD的細胞“凋亡小體”，在胞質(zhì)中dATP的作用下進一步激活Caspase-9?；罨蟮腃aspase-9能激活作為細胞凋亡執(zhí)行者的Caspase-3，通過特異性地裂解一套底物而導(dǎo)致細胞凋亡[22-24]。本研究檢測到完全性脊髓損傷后模型大鼠脊髓中Cyt-C、Apaf-1及活化Caspase-9蛋白的表達明顯升高，說明發(fā)生了脊髓組織中神經(jīng)元的繼發(fā)性凋亡；電針對Cyt-C、Apaf-1及活化Caspase-9蛋白表達有明顯抑制作用，結(jié)合脊髓凋亡情況的結(jié)果，說明電針可以通過降低脊髓凋亡率，緩解脊髓繼發(fā)性凋亡，改善膀胱的神經(jīng)支配，從而促進膀胱功能的恢復(fù)。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明，骶上完全性脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠的脊髓組織中凋亡細胞增加，且線粒體促凋亡途徑Cyt-C、Apaf-1及活化Caspase-9含量升高，激活凋亡程序引起細胞凋亡；電針次髎、中極、三陰交、大椎可減少脊髓組織中Cyt-C、Apaf-1及活化Caspase-9蛋白的表達量，緩解脊髓繼發(fā)性損傷，從而改善膀胱的神經(jīng)支配，保護膀胱功能。本實驗從線粒體途徑Cyt-C、Apaf-1及活化Caspase-9蛋白含量表達結(jié)合尿流動力學(xué)檢測，部分說明電針對骶上完全性脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱的治療效果可能是通過改善膀胱神經(jīng)支配而實現(xiàn)的，其上下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路值得進一步研究。

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Effect of Electroacupuncture on Expression of Caspase-9,Cytochrome C and Apoptotic Protease Activating Factor 1 in Spinal Tissue in Rats with Neurogenic Bladder after Complete Spinal Cord Injury

XU Ming,ZHANG Hong,LIU Ji-sheng,YIN Xiu-ting,ZHANG Jian,HUANG Gui-lan,AI Kun
Hunan University of TCM,Changsha,Hunan 410208,China

ZHANG Hong.E-mail:zh5381271@sina.com

Objective To observe the effect of electroacupuncture on Caspase-9,cytochrome C(Cyt-C)and apoptotic protease activating factor 1(Apaf-1)protein in rats with neurogenic bladder after complete spinal cord injury.Methods A total of 60 female Sprague-Dawley rats were involved,in which 36 rats were randomly selected to establish the neurogenic bladder model with T10spinal cord transected.24 successful models selected were randomly divided into model group(n=12)and electroacupuncture group(n=12).The other 24 rats were also randomly divided into sham group(n=12)and blank group(n=12).The electroacupuncture group was electroacupunctured on Ciliao (BL32),Zhongji(RN3),Sanyinjiao(SP6)and Dazhui(GV14)for seven days.All of them were assessed with urodynamic test,TUNEL method was used to determine the apoptosis rate of the spinal cord,and Western blotting was used to detect the expression of Caspase-9, Cyt-C and Apaf-1 protein.Results Compared with the blank group and the sham group,the maximum bladder capacity and compliance decreased(P＜0.01),the urinary bladder pressure and leakage point pressure increased(P＜0.05);the apoptosis rate of the spinal cord increased (P＜0.001);the expression of Caspase-9,Cyt-C and Apaf-1 protein increased(P＜0.05)in the model group and the electroacupuncture group. Compared with the model group,the maximum bladder capacity and compliance increased(P＜0.01),the urinary bladder pressure and leakage point pressure decreased(P＜0.05);the apoptosis rate of the spinal cord decreased(P＜0.05);the expression of Caspase-9,Cyt-C and Apaf-1 protein decreased(P＜0.05)in the electroacupuncture group.Conclusion Electroacupuncture on Ciliao,Zhongji,Sanyinjiao and Dazhui could improve the bladder function after spinal cord injury in rats.The mechanisms may be related with the down-regulation of Caspase-9,Cyt-C andApaf-1 protein to reduce apoptosis.

spinal cord injury;neurogenic bladder;electroacupuncture;Caspase-9;cytochrome C;apoptotic protease activating factor1;apoptosis;rats

R651.2

A

1006-9771(2017)06-0628-06

2016-10-17

2016-12-21)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.06.002

國家自然科學(xué)基金面上項目(No.81473753)。

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙市410208。作者簡介：許明(1990-)，男，漢族，湖南益陽市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)機理與臨床研究。通訊作者：張泓(1963-)，男，漢族，湖南常德市人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)機理與臨床研究。E-mail:zh5381271@sina.com。