水通道蛋白在大鼠急性壞死性胰腺炎結(jié)腸中的表達(dá)及意義

陳影 謝榮理 王金龍 祁夢(mèng)之 楊之濤 許志偉 費(fèi)健 毛恩強(qiáng) 陳爾真

·論著·

水通道蛋白在大鼠急性壞死性胰腺炎結(jié)腸中的表達(dá)及意義

陳影 謝榮理 王金龍 祁夢(mèng)之 楊之濤 許志偉 費(fèi)健 毛恩強(qiáng) 陳爾真

目的 觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠結(jié)腸組織內(nèi)水通道蛋白(AQP)表達(dá)的變化。方法 采用經(jīng)胰膽管逆行注射?；悄懰徕c的方法建立ANP大鼠模型。制模后4、8、12、24 h處死大鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只，取結(jié)腸組織行病理學(xué)檢查，采用 RT-PCR 法檢測(cè)近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸組織IL-6、TNF-α mRNA和AQP(AQP-3、AQP-4、AQP-8)mRNA的表達(dá)；采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)結(jié)腸組織中AQP的表達(dá)。結(jié)果 制模后SD大鼠結(jié)腸黏膜連續(xù)性被破壞，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，絨毛斷裂、脫落，黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，病理評(píng)分隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而升高。除造模后4 h遠(yuǎn)端結(jié)腸組織的AQP-4 mRNA無(wú)顯著變化外，其他時(shí)間點(diǎn)ANP大鼠近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸組織的IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)，AQP-3、AQP-4、AQP-8 mRNA及蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。ANP大鼠近端結(jié)腸AQP-3、AQP-8的mRNA表達(dá)在造模后8 h時(shí)達(dá)峰值，AQP-4 mRNA表達(dá)在24 h達(dá)峰值；遠(yuǎn)端結(jié)腸AQP-3、AQP-4 mRNA表達(dá)在8 h時(shí)達(dá)峰值，AQP-8 mRNA表達(dá)在24 h達(dá)峰值；近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸AQP-3、AQP-4、AQP-8蛋白表達(dá)在12、24 h時(shí)最強(qiáng)。結(jié)論 ANP大鼠近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸AQP-3、AQP-4、AQP-8 mRNA和蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，并隨著病程的進(jìn)展逐步升高，提示其可能參與ANP時(shí)結(jié)腸的水代謝過(guò)程。

胰腺炎，急性壞死性； 水通道蛋白； 結(jié)腸； 膜蛋白類

Fund program：This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81600501, 81670581, 81671901, 81571931)

水通道蛋白(aquaporin, AQP)是一類位于細(xì)胞膜上的整合膜蛋白，屬于主要內(nèi)源性蛋白(major intrinsic protein，MIP)家族。它在細(xì)胞膜上組成“孔道”，控制水在細(xì)胞內(nèi)的進(jìn)出，且不允許離子或其他小分子物質(zhì)(包括蛋白質(zhì))通過(guò)[1-2]。AQP廣泛分布于人體各個(gè)臟器組織的細(xì)胞膜上，參與機(jī)體幾乎所有的生理與病理過(guò)程，與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。結(jié)腸最重要的生理功能之一是液體的吸收與分泌。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸大量表達(dá)AQP[4-5]，AQP的異常表達(dá)可導(dǎo)致結(jié)腸對(duì)水的吸收與分泌紊亂[6-8]。重癥急性胰腺炎(SAP)發(fā)病早期釋放大量炎癥因子，增加毛細(xì)血管通透性，導(dǎo)致大量體液滲漏，進(jìn)而減少有效循環(huán)血量，從而影響結(jié)腸黏膜上皮的通透性及水代謝。本研究通過(guò)構(gòu)建急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠模型，觀察ANP大鼠結(jié)腸中AQP的表達(dá)，探討其對(duì)ANP時(shí)結(jié)腸水代謝的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

30只健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，清潔級(jí)。于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后按數(shù)字表法隨機(jī)分為ANP組(24只)和假手術(shù)組(6只)。采用經(jīng)胰膽管注射5%?；悄懰徕c溶液(Sigma-Aldrich公司)0.1 ml/100 g體重的方法制備ANP模型[9]，制模后4、8、12、24 h分批處死大鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只，取結(jié)腸組織。假手術(shù)組開腹后翻動(dòng)胰腺和十二指腸組織后關(guān)腹，12 h后處死大鼠，取結(jié)腸組織。部分結(jié)腸組織置4%多聚甲醛液中固定，常規(guī)制備石蠟切片；部分結(jié)腸組織即刻置液氮中凍存。

二、結(jié)腸組織病理學(xué)檢查

取4%多聚甲醛固定的結(jié)腸組織，經(jīng)脫水、透明、透蠟、包埋、切片后行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡(100×)下觀察組織的病理變化，并參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行病理評(píng)分。

三、RT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸組織AQP、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)

取小塊液氮凍存的大鼠結(jié)腸組織，在研缽中加入液氮碾磨，加入500 μl Trizol(Invitrogen公司)反復(fù)抽吸混勻，裝入DEPC水處理過(guò)的1.5 ml離心管中。每管加入預(yù)冷的氯仿200 ml，顛倒混勻多次，室溫靜置5 min后于4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清，加入等容積異丙醇混勻，室溫靜置5 min后于4℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清。用1 ml預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀后于4℃、8 000 r/min離心5 min，棄上清，置室溫下待乙醇完全揮發(fā)后加入DEPC水，混勻后于65℃加熱5 min以充分溶解RNA。采用生物分光光度法分析RNA純度及濃度，置-80℃冰箱保存。采用RT-PCR方法檢測(cè)組織AQP、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。各引物序列見(jiàn)表1，由Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成。RT試劑盒及熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司，嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。

表1 AQP、IL-6、TNF-α基因及內(nèi)參β-actin的引物序列

四、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)腸組織中AQP蛋白的表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)試劑盒(Histostain-Plus IHC Kit, Life technologies公司)檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。兔抗大鼠AQP-3、AQP-4抗體和山羊抗大鼠AQP-8抗體分別購(gòu)自Abcam公司及Santa Cruz Biotechnology有限公司，工作濃度均為1∶500。以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片在光鏡下觀察6個(gè)高倍鏡視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、大鼠結(jié)腸組織的病理變化

假手術(shù)組大鼠近端結(jié)腸黏膜上皮完整、無(wú)明顯水腫，上皮細(xì)胞排列整齊，黏膜下層見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)。ANP 4 h組大鼠結(jié)腸上皮病理表現(xiàn)與假手術(shù)組基本相似，黏膜上皮基本完整，無(wú)明顯水腫，上皮細(xì)胞偶見(jiàn)結(jié)構(gòu)模糊；8、12 h起病變逐漸加重，上皮細(xì)胞排列紊亂，黏膜上皮不完整，絨毛萎縮、斷裂、脫落，黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)；造模后24 h的結(jié)腸病理?yè)p傷最明顯。各組大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸病變基本同近端結(jié)腸相似，略輕于近端結(jié)腸(1C、1D)。造模后8 h起黏膜連續(xù)性被破壞，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，絨毛斷裂、脫落，黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，造模后24 h病變最嚴(yán)重。大鼠近端、遠(yuǎn)端結(jié)腸病理評(píng)分隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而升高，以24 h的評(píng)分最高(表2)。

二、各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平的變化

ANP大鼠近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸組織IL-6 mRNA表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P值均<0.05)。近端結(jié)腸IL-6 mRNA表達(dá)在24 h達(dá)到峰值，其中8、24 h的表達(dá)顯著高于4 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；遠(yuǎn)端結(jié)腸在12 h達(dá)到峰值，其中8 h的表達(dá)顯著高于4 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表2 各組大鼠近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸組織的病理評(píng)分

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05;與ANP 4 h組比較，bP<0.05；與ANP 8 h組比較，cP<0.05

圖1 假手術(shù)組、ANP 12 h組大鼠近端((1A、1B)及遠(yuǎn)端結(jié)腸組織(1C、1D)的病理變化(HE ×100)

ANP大鼠近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸組織TNF-α mRNA表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P值均<0.05)。近端結(jié)腸TNF-α mRNA表達(dá)在24 h達(dá)到峰值，但各時(shí)間點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；遠(yuǎn)端結(jié)腸TNF-α mRNA表達(dá)在12 h達(dá)到峰值，隨后降低，其中12 h的表達(dá)顯著高于4 h及24 h，8 h的表達(dá)顯著高于24 h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表4)。

三、各組大鼠結(jié)腸組織AQP mRNA表達(dá)水平的變化

ANP大鼠近端結(jié)腸AQP-3、AQP-8 mRNA表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。AQP-3、AQP-8 mRNA表達(dá)在8 h時(shí)達(dá)峰值，12、24 h時(shí)的表達(dá)較8 h時(shí)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，但12 h與24 h間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。近端結(jié)腸AQP-4 mRNA表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，24 h達(dá)峰值，但各時(shí)間點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

ANP大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸AQP-3、AQP-8 mRNA表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。AQP-3 mRNA表達(dá)在8 h時(shí)達(dá)峰值，以后開始下降，但各時(shí)間點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AQP-8 mRNA表達(dá)于24 h達(dá)峰值，顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)的水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。AQP-4 mRNA表達(dá)在4 h點(diǎn)略低于假手術(shù)組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；8 h 時(shí)升高達(dá)峰值，顯著高于假手術(shù)組及ANP12、24 h組，而12、24 h的表達(dá)仍顯著高于假手術(shù)組和4 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表4)。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平的變化

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05;與ANP 4 h組比較，bP<0.05；與ANP 24 h組比較，cP<0.05

表4 各組大鼠結(jié)腸組織AQP mRNA表達(dá)水平的變化

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05;與ANP 4 h組比較，bP<0.05；與ANP 8 h組比較，cP<0.05；與ANP 12 h組比較，dP<0.05

四、各組大鼠結(jié)腸組織AQP蛋白表達(dá)水平的變化

AQP蛋白主要表達(dá)于結(jié)腸上皮細(xì)胞胞質(zhì)，表現(xiàn)為出現(xiàn)棕黃色顆粒。假手術(shù)組大鼠近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸均可見(jiàn)AQP-3表達(dá)；ANP組4、8 h時(shí)表達(dá)略增加，12、24 h時(shí)表達(dá)進(jìn)一步增加(圖2)。

假手術(shù)組大鼠近端結(jié)腸上皮細(xì)胞僅少量AQP-4表達(dá)；ANP組4、8 h時(shí)表達(dá)無(wú)顯著增加，12、24 h表達(dá)顯著增加；遠(yuǎn)端結(jié)腸上皮細(xì)胞AQP-4表達(dá)均高于近端結(jié)腸，變化趨勢(shì)同近端結(jié)腸(圖3)。

假手術(shù)組大鼠近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸均表達(dá)大量 AQP-8，ANP組4、8 h時(shí)的表達(dá)無(wú)明顯變化，12、24 h的表達(dá)較假手術(shù)組增加(圖4)。

討 論

SAP是一種嚴(yán)重的全身性疾病，涉及多器官功能損害。SAP早期，一方面由于大量炎癥遞質(zhì)的釋放及血容量不足引起腸道缺血缺氧損傷，另一方面由于胰腺的特殊解剖位置，胰周的空腸、回腸及橫結(jié)腸等為首要受累臟器，發(fā)生急性胃腸功能損傷(acute gastrointestinal injury，AGI)[11-12]。本研究結(jié)果顯示，ANP大鼠的近端、遠(yuǎn)端結(jié)腸由于組織缺血缺氧、炎癥打擊，出現(xiàn)黏膜、絨毛的斷裂、脫落，且結(jié)腸上皮細(xì)胞IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)顯著增加。結(jié)腸平均每日吸收1.3～2 L水[4-5,13]，結(jié)腸內(nèi)的水分實(shí)際上是逆滲透壓梯度從管腔進(jìn)入血管從而完成吸收這一生理功能的，但其具體機(jī)制并不十分明確。以往的研究表明，結(jié)腸內(nèi)水分的吸收屬于被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，各種溶質(zhì)(特別是NaCl)主動(dòng)吸收所產(chǎn)生的滲透壓梯度促使水分吸收進(jìn)入腸上皮細(xì)胞[14]。但隨著生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，越來(lái)越多的證據(jù)表明結(jié)腸水分的轉(zhuǎn)運(yùn)不僅僅依賴Na+等溶質(zhì)的易化擴(kuò)散方式，還可能存在細(xì)胞旁路、載體系統(tǒng)、通道等其他主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[14-16]，它們可能在機(jī)體炎癥、缺血缺氧等病理狀態(tài)下對(duì)結(jié)腸水代謝起不可或缺的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)消化道有大量AQP表達(dá)[4-5,17]，提示經(jīng)細(xì)胞途徑的水分吸收機(jī)制除了簡(jiǎn)單擴(kuò)散外還存在特殊的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的快速水轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[4,18]。

圖2 假手術(shù)組、ANP12 h組大鼠近端(2A、2B)及遠(yuǎn)端結(jié)腸組織(2C、2D)的AQP-3蛋白表達(dá)(免疫組化 ×100)

圖3 假手術(shù)組、ANP12 h組大鼠近端(3A、3B)及遠(yuǎn)端結(jié)腸(3C、3D)的AQP-4蛋白表達(dá)(免疫組化 ×100)

圖4 假手術(shù)組、ANP12 h組大鼠近端(4A、4B)及遠(yuǎn)端結(jié)腸(4C、4D)的AQP-8蛋白表達(dá)(免疫組化 ×100)

Silberstein等[19]最初發(fā)現(xiàn)，AQP-3局限在結(jié)腸絨毛上皮細(xì)胞表達(dá)，并優(yōu)勢(shì)表達(dá)于結(jié)腸絨毛上皮細(xì)胞的頂膜，提示AQP-3與人類結(jié)腸上皮細(xì)胞對(duì)水分的吸收有一定的相關(guān)性。Ikarashi等[20]發(fā)現(xiàn)抑制結(jié)腸AQP-3功能可引起糞便含水量增加而導(dǎo)致腹瀉。此外，有研究顯示，腹瀉型腸易激綜合征患者AQP-8表達(dá)下降，導(dǎo)致結(jié)腸吸收功能障礙，可能與大便稀溏、腹瀉等有關(guān)[21]。AQP-4主要表達(dá)于人的升結(jié)腸，有學(xué)者應(yīng)用AQP-4基因敲除小鼠進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸對(duì)水的通透性與AQP-4在結(jié)腸的表達(dá)與否及表達(dá)量的多少呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，正常SD大鼠的結(jié)腸，無(wú)論近端或是遠(yuǎn)端，均有AQP-3、AQP-8表達(dá)，而AQP-4在近端結(jié)腸僅有少量表達(dá)。ANP大鼠近端及遠(yuǎn)端結(jié)腸AQP-3、AQP-4、AQP-8 mRNA和蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，并隨著病程的進(jìn)展逐步升高，提示AQP可能參與了ANP早期結(jié)腸的水吸收與分泌等轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

本課題組在臨床治療SAP患者時(shí)觀察到灌入患者直腸內(nèi)的生理鹽水均被吸收，每小時(shí)吸收的生理鹽水可高達(dá)500 ml，而心率、血壓等指標(biāo)均有改善，患者每小時(shí)尿量亦可達(dá)到25～150 ml，且未見(jiàn)患者發(fā)生腹腔壓力升高以及嚴(yán)重的組織水腫。對(duì)ANP大鼠經(jīng)直腸持續(xù)勻速輸入生理鹽水8 h，大鼠的平均動(dòng)脈壓逐漸升高，并可回復(fù)到對(duì)照組大鼠的水平[22]。因此筆者認(rèn)為，在SAP早期由于有效循環(huán)血量不足使機(jī)體處于“缺水”狀態(tài)，除通過(guò)各種神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)來(lái)減少水分丟失外，亦通過(guò)一切可能途徑吸收水分。經(jīng)結(jié)腸吸收水分可有效地補(bǔ)充血容量，改善血流動(dòng)力學(xué)紊亂，是機(jī)體的一種主動(dòng)調(diào)節(jié)的自我保護(hù)機(jī)制。ANP大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞AQP-3、AQP-4、AQP-8表達(dá)上調(diào)可能是結(jié)腸主動(dòng)增加水吸收的重要機(jī)制之一。

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(本文編輯：呂芳萍)

Expression and role of aquaporin in the colon of acute necrotizing pancreatitis rats

ChenYing,XieRongli,WangJinlong,QiMengzhi,YangZhitao,XuZhiwei,FeiJian,MaoEnqiang,ChenErzhen.

DepartmentofEmergency,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China

XuZhiwei,Email:xzw10800@163.com

Objective To investigate the expression variation of aquaporin in colon tissues in acute necrotizing pancreatitis (ANP). Methods ANP rat model was induced by the retrograde injection of sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. The rats were killed at 4 h, 8 h, 12 h and 24 h after modeling with 6 rats for each time point. The pancreas and colon tissues were harvested for pathological examination. The levels of IL-6, TNF-α mRNA expression and AQR (aquaporin-3, aquaporin-4, aquaporin-8) mRNA expression in proximal and distant colon were detected by RT-PCR. The levels of aquaporin protein in colon were examined by immunohistochemistry. Results After the establishment of ANP SD rat model, the integrity of colonic mucosa was continuously damaged, the structure of epithelial cells was unclear and the colonic villus were broken and destroyed, and inflammatory cell infiltration in submucosa was observed. The pathological score increased with the time of modeling. In 4 h, except that the mRNA levels of AQP-4 in distal colon was not obviously changed, mRNA levels of IL-6 and TNF-α, mRNA and protein expression of AQP-3 and AQP-8 in the proximal and distal colon of ANP rats were significantly elevated compared with shame group (P<0.05). AQP-3 and AQP-8 mRNA in proximal colon of ANP rats reached its peak in 8 h after the establishment and AQP-4 mRNA peaked at 24 h. AQP-3 and AQP-4 mRNA in distant colon of ANP rats reached its peak in 8 h after the establishment and AQP-8 mRNA peaked at 24 h. Protein expression of AQP-3, AQP-4 and AQP-8 in proximal and distant colon was strongest in 12 h and 24 h after the establishment. Conclusions With the progression of the ANP, the expression levels of AQP-3, AQP-4 and AQP-8 in both proximal and distal colons were elevated in various degrees, indicating that the aquaporins may participate in water metabolism of colon during ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Aquaporin; Colon; Membrane proteins

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.03.005

200025 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院急診科(陳影、王金龍、祁夢(mèng)之、楊之濤、毛恩強(qiáng)、陳爾真)，普通外科(謝榮理、許志偉、費(fèi)健)

并列第一作者：謝榮理

許志偉，Email: xzw10800@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(81600501、81670581、81671901、81571931)

2016-11-21)