萊菔硫烷對(duì)C57BL/6小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用

李寶龍，單毓娟，劉旭，李松濱，劉永武，姜波

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150090)

萊菔硫烷對(duì)C57BL/6小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用

李寶龍1，單毓娟2*，劉旭1，李松濱1，劉永武1，姜波1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150090)

目的：研究萊菔硫烷對(duì)酒精誘發(fā)的肝臟功能異常的保護(hù)作用。方法：雄性C57BL/6 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組(n=12)：陰性對(duì)照組、酒精模型組、SFN處理組(SFN的劑量分別為10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg),先給處理組動(dòng)物經(jīng)口灌胃不同劑量的SFN共10 d(1次/d),在末次灌胃SFN后，立即給予酒精模型組和SFN處理組動(dòng)物酒精(5 g/kg)，每12 h 1次，共3次,末次給予酒精4h后結(jié)束整個(gè)實(shí)驗(yàn),常規(guī)HE染色觀察肝臟病理變化,采用半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清、肝勻漿中相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平。結(jié)果：病理學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)表明，成功建立了小鼠急性酒精性肝損傷模型,萊菔硫烷能明顯減輕酒精對(duì)肝臟的病理學(xué)損傷，高劑量萊菔硫烷保護(hù)組的作用明顯,萊菔硫烷能保護(hù)酒精對(duì)AST、ALT、ALP3種代謝酶功能的損傷,萊菔硫烷能提高肝勻漿抗氧化酶SOD和GSH-Px活性，降低脂質(zhì)過氧化物MDA的水平。結(jié)論: 萊菔硫烷能保護(hù)酒精對(duì)肝臟功能的損傷，其主要作用機(jī)制與SFN提高了酒精代謝的關(guān)鍵酶SOD和GSH-Px活性密切相關(guān)。

萊菔硫烷；肝損傷；酒精代謝；抗氧化

有研究顯示，全球人均年酒精的攝入量已達(dá)6.2 L[1]，過量攝入酒精將危及多種器官的正常功能，從而增加疾病風(fēng)險(xiǎn)。肝臟是人體重要的代謝、解毒器官，也是受酒精毒害的首要器官。在酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制中，氧化性應(yīng)激損傷起了關(guān)鍵的作用。萊菔硫烷(sulforaphane, SFN)富含于十字花科蔬菜中，具有代謝解毒、抗氧化、組蛋白去乙酰化等活性[2-7]，是一種極具開發(fā)價(jià)值的Ⅱ相代謝酶誘導(dǎo)劑[8]。同時(shí)萊菔硫烷作為一種間接抗氧化劑，可通過激活抗氧化酶活性和升高抗氧化物的水平來發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用[9]。據(jù)此推測(cè)萊菔硫烷能通過抗氧化途徑來保護(hù)急性酒精攝入后對(duì)肝臟的損傷作用。為驗(yàn)證上述假設(shè)，本研究擬通過預(yù)先給予萊菔硫烷以誘導(dǎo)體內(nèi)部的抗氧化能力，隨后急性投予酒精，探究萊菔硫烷的保護(hù)性作用及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

萊菔硫烷購(gòu)自LKT laboratories公司(英國(guó))。GSH-Px、SOD和MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司(南京，中國(guó))。Bradford 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所(上海，中國(guó))；AST、ALT和 ALP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技公司(北京，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)

SPF級(jí)雄性C57BL/6 小鼠(5周齡)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001，在屏障環(huán)境內(nèi)經(jīng)過5天的適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行正式分組及實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水、攝食。SPF級(jí)60Co輻照滅菌小鼠維持飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度22～24℃、相對(duì)濕度55%～60%、照明12 h/12 h晝夜交替進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

60只雄性C57BL/6 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組(n=12)，分別是陰性對(duì)照組、酒精模型組、SFN處理組(SFN的劑量分別為10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，給處理組動(dòng)物經(jīng)口灌胃不同劑量的SFN，每天1次，灌胃10 d。急性酒精性肝損傷模型參照Carson 和 Pruett的方法構(gòu)建，動(dòng)物在末次灌胃SFN后，立即給予酒精模型組和SFN處理組動(dòng)物酒精(5 g/kg)，每12 h 1次，共給予3次，末次給予酒精4 h后，眼球取血制備血清，頸椎脫臼處死動(dòng)物。陰性對(duì)照組給予等熱量的葡萄糖。

1.4 肝臟組織病理檢查

剪取肝臟右葉，以10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色，制片后光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織基本病理變化。

1.5 肝勻漿制備及氧化還原指標(biāo)的測(cè)定

取0.5 g肝左葉在預(yù)冷的生理鹽水(NS)中漂洗數(shù)次，濾紙吸干后加入4.5 mL預(yù)冷NS勻漿。用眼科剪盡快剪碎組織塊，并于玻璃器皿中制成10%肝組織混懸液，然后在4℃條件下以10 000 r/min離心20 min，取上清(即為肝勻漿)分裝于EP管中，置于冰箱(-80℃)中冷凍保存。按照試劑盒說明，用酶標(biāo)儀測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量。

1.6 血清肝功能生化指標(biāo)測(cè)定

血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)的活性采用中生北控生物科技公司的試劑盒，用半自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 SFN對(duì)酒精引起的肝臟病理學(xué)異常的保護(hù)作用

光鏡下觀察，陰性對(duì)照組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀整齊排列，肝小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞分界清，核圓而清晰，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)豐富，無脂肪變性和炎癥反應(yīng)，見圖1A。模型組小鼠肝小葉界限不清，肝細(xì)胞漿出現(xiàn)不同程度的空泡變性，以肝包膜下的肝細(xì)胞為明顯，輕者肝細(xì)胞漿松化呈網(wǎng)狀，重者胞體腫大或呈球形，胞漿透明，肝竇受壓、紊亂。小葉各帶可見散在的點(diǎn)、灶狀壞死，主要見于中央靜脈周圍區(qū)，壞死灶及肝竇內(nèi)可見較多量嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1B。高劑量SFN預(yù)保護(hù)組細(xì)胞索排列較整齊，肝細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形，細(xì)胞分界清，核圓而清晰，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)未見脂肪滴，見圖1C。低、中劑量的SFN組肝細(xì)胞中濁腫明顯減輕，有散在炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞內(nèi)偶有小脂滴，見圖1E和1D。

2.2 萊菔硫烷對(duì)小鼠血清中ALT、AST、ALP水平的影響

由表1可知，與陰性對(duì)照組相比，酒精模型組小鼠血清中ALT水平明顯升高(P<0.01)，為模型組ALT水平的3.9倍，AST、ALP水平也有升高(P<0.05)，分別為模型組的1.27倍、1.51倍，提示酒精引起了肝臟的損傷。給予萊菔硫烷后，與酒精模型組相比，低劑量組ALT、AST、ALP水平未出現(xiàn)差異性變化，中劑量組ALT、AST、ALP水平明顯降低(P<0.01或P<0.05)，高劑量組ALT、ALP水平也明顯降低(P<0.01)，并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系；而AST水平僅在中劑量SFN預(yù)保護(hù)組有顯著性差異。

圖1 酒精對(duì)肝臟攝入的影響及SFN的保護(hù)作用(×400)注：A.陰性對(duì)照組；B.酒精模型組；C.SFN(40 mg/kg)；D.SFN(20 mg/kg)；E.SFN(10 mg/kg)

表1 萊菔硫烷對(duì)小鼠血清中相關(guān)代謝酶活性的影響

注：與陰性對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與酒精模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 SFN對(duì)酒精引起的肝臟氧化性損傷的保護(hù)作用

由表2可知，急性酒精刺激后，酒精模型組肝組織中的抗氧化酶SOD、GSH-Px活性分別降低27%和34%，而MDA含量升高較為明顯，達(dá)86%(P<0.01)。中、高劑量SFN 能夠明顯的保護(hù)酒精對(duì)GSH-Px活力的抑制作用，與模型組(274.92±79.76)相比，約升高30%～32%；SFN對(duì)SOD活性的保護(hù)作用呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，與模型組比較，約升高17%～46%，以中高劑量SFN的保護(hù)作用更加強(qiáng)烈。SFN能明顯降低MDA產(chǎn)生，降低幅度在39%～43%(P<0.05)，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表2 SFN對(duì)小鼠肝組織抗氧化酶和MDA的影響

注：與陰性對(duì)照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與酒精模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

本研究結(jié)果表明，SFN能增強(qiáng)抗氧化酶的活性、抑制脂質(zhì)過氧化物的生成，從而保護(hù)酒精對(duì)肝臟功能的損傷作用。急性酒精刺激后，肝組織中表現(xiàn)出的空泡變性、肝細(xì)胞漿疏松化甚至腫大；肝小葉散在的點(diǎn)、灶狀壞死及肝竇內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，均說明了肝臟受損。高劑量(40 mg/kg)SFN能夠明顯保護(hù)肝臟組織，其組織學(xué)表現(xiàn)已經(jīng)接近了陰性對(duì)照組，說明SFN能夠保護(hù)急性酒精性肝損傷。

酒精攝入后造成肝損害，其明顯特征是細(xì)胞酶外漏至血漿[10]。本研究發(fā)現(xiàn)急性酒精攝入后， AST、ALT、ALP等水平的增高，提示肝功能受損，該結(jié)果與前人結(jié)果一致[10]；同時(shí)ALT的變化比AST敏感，有可能是由于二者亞細(xì)胞定位不同所致，ALT位于細(xì)胞質(zhì)，而AST位于線粒體中，只有損傷比較嚴(yán)重時(shí)AST釋放量才增加。Seung HK等[11]人研究發(fā)現(xiàn)，SFN可改善CCl4所致肝組織中MDA生成。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是導(dǎo)致酒精性肝損傷的重要原因。自由基的生成以及脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生在酒精產(chǎn)生肝內(nèi)外毒性的機(jī)制上扮演了重要角色[12]。酒精通過細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)和乙醇脫氫酶(ADH)介導(dǎo)生成很多自由基，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[13]。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中具有代表性的產(chǎn)物，其含量的多少預(yù)示脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度。因此測(cè)定組織中MDA的含量?？煞从持|(zhì)過氧化反應(yīng)的強(qiáng)弱，間接反映細(xì)胞損傷程度[14]。SOD清除過多的超氧化陰離子，并將其轉(zhuǎn)化成H2O2，再由GSH-Px和CAT進(jìn)一步氧化成O2和H2O，減少自由基的產(chǎn)生，降低脂質(zhì)過氧化的生成并加速其清除，從而減輕肝細(xì)胞損傷[15-16]。SFN正式通過抑制上述一系列的級(jí)聯(lián)式反應(yīng)中的關(guān)鍵酶如SOD和GSH-Px，加強(qiáng)了機(jī)體清除MDA的能力，最終保護(hù)了肝臟功能。

綜上，本研究結(jié)果表明SFN預(yù)保護(hù)后，再給予小鼠急性酒精刺激，能明顯保護(hù)小鼠急性酒精性肝損傷；其初步作用機(jī)制與SFN提高了酒精代謝的關(guān)鍵酶SOD和GSH-Px活性有關(guān)。

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Preventive Effects of Sulforaphane on Acute Alcoholic Hepatic Injury Model of C57BL/6 Mice

LI Bao-long1, SHAN Yu-juan2, LIU Xu1, LI Song-bin1, LIU Yong-wu1, JIANG Bo1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090,China)

Objective：To investigate the effects of sulforaphane (SFN) on abnormal function of liver induced by alcohol. Methods：Male C57BL/6 mice were randomly divided into 5 groups (n=12), which were the negative control group, alcohol model group, and SFN pretreatment group (10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg). Mice were daily gavaged SFN with different dose for ten days. At the end of last intake of SFN, mice in groups of the alcohol model and SFN pretreatment were gavaged alcohol(5 g/kg) every 12 hours for 3 times. The whole experiment was ended after 4 hours of last alcohol intake. HE staining was performed to check the pathological changes of liver. Blood and liver homogenates were collected to measure the expression levels of the relevant indicators by semi-automatic biochemistry analyzer. Results: The acute hepatic injury model was successfully established in C57BL/6 mice, as shown by indicators of pathology and serum. SFN, in high dose especially could lessen the pathological damage induced by alcohol. Also SFN significantly inversed the activities of AST, ALT and ALP induced by alcohol. SFN obviously activated the anti-oxidant enzymes including SOD and GSH-Px. Additionally, SFN pretreatment could inhibit the alcohol-induced MDA level, products of lipid peroxidation in dose-dependent way. Conclusion: SFN can protect the functions of liver damaged by alcohol. The main mechanisms may be associated with enhancing the antioxidant-enzymes, which are in charge of the metabolisms of alcohol.

Sulforaphane; Hepatic Injury/Liver damage; Alcohol metabolism; Antioxidant

2016-05-03

2016-12-30

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12541763)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81573135)

李寶龍(1973-)， 男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥及植物提取物抗衰老研究。

*通訊作者：?jiǎn)呜咕?1972-)，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事植物化學(xué)物的生物活性及分子機(jī)制研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0013-03