歐美楊111號(hào)組織培養(yǎng)再生體系的建立

矯麗曼

（遼寧省楊樹(shù)研究所，遼寧 蓋州 115200）

歐美楊111號(hào)組織培養(yǎng)再生體系的建立

矯麗曼

（遼寧省楊樹(shù)研究所，遼寧 蓋州 115200）

以歐美楊111號(hào)葉片為外植體，以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA、6-BA和IBA，觀察不定芽誘導(dǎo)和生根情況，確定歐美楊111號(hào)植株再生體系。結(jié)果顯示：歐美楊111號(hào)葉片最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂6 g·L-1，pH值6.5，不定芽分化率為96.67%；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂6 g·L-1，pH值6.0，全部生根，平均根數(shù)13.2條。

歐美楊111號(hào)；組織培養(yǎng)；再生體系；外植體

歐美楊111號(hào)Populus euramericana‘Bellotto’植物新品種保護(hù)登記名稱為“貝洛托111”，是意大利楊樹(shù)研究所利用人工控制授粉，通過(guò)有性雜交試驗(yàn)所獲得的雜交無(wú)性系，雌性植株。母本為美洲黑楊P.deltoides‘217/958’，父本是自由授粉的歐美楊無(wú)性系。1984年中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院張綺紋從意大利引入［1］。2002年通過(guò)國(guó)家林業(yè)局植物新品種保護(hù)審定，編號(hào)：20020005。歐美楊111號(hào)樹(shù)干通直、樹(shù)冠窄小、側(cè)枝細(xì)、樹(shù)形美觀，生長(zhǎng)速度快，是有很強(qiáng)的耐旱、耐低溫、抗害蟲(chóng)、抗?jié)儾〉膬?yōu)良品種，無(wú)性繁殖容易，抗風(fēng)能力強(qiáng)，落葉期晚，輪伐期短，材質(zhì)好，是紙漿材和板材的優(yōu)良原材料，適合在我國(guó)東北的南部、華北、華東、內(nèi)蒙、華南及西南等廣大地區(qū)種植［2-4］。

為提高歐美楊111號(hào)的抗逆性，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的手段將帶有特異功能的外源基因?qū)塍w內(nèi)，在受體上表達(dá)，而組織培養(yǎng)再生體系的建立為轉(zhuǎn)基因的成功提供了基礎(chǔ)與前提。本文建立了歐美楊111號(hào)組織培養(yǎng)再生體系，為該楊樹(shù)品種的廣泛推廣、抗性及分子水平的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年3月末從遼寧省楊樹(shù)研究所錦州市金城苗圃采集歐美楊111號(hào)1年生枝條，置于室內(nèi)水培萌發(fā)，幼葉伸展后，以萌發(fā)的幼葉作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 歐美楊111號(hào)外植體的選擇及預(yù)處理［5-7］

選取萌發(fā)伸展長(zhǎng)度在1 cm以上的幼葉，用剪刀將葉片剪下，用自來(lái)水沖洗干凈，放入無(wú)菌平皿中。在無(wú)菌條件下，用75%的乙醇溶液沖洗3次，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡5 min，取出后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，用無(wú)菌剪刀將葉片的兩端剪掉，并在葉片中間與葉脈平行處剪開(kāi)幾個(gè)裂口，即獲得無(wú)菌外植體葉片。

1.2.2 不定芽分化培養(yǎng)基的優(yōu)化［8-10］

不定芽分化培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA和6-BA（表1），將處理好的無(wú)菌外植體分別接種于不同培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，同時(shí)培養(yǎng)基中添加蔗糖25 g·L-1、瓊脂6 g·L-1，pH值6.5，每個(gè)處理重復(fù)3次，共接30個(gè)葉片。

1.2.3 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化［11-12］

生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA（表2），同時(shí)添加蔗糖20 g·L-1，瓊脂6 g·L-1，pH值6.0。剪下生長(zhǎng)長(zhǎng)度超過(guò)2 cm的不定芽，每瓶接2個(gè)不定芽，4瓶為1個(gè)處理，重復(fù)3次，共接24個(gè)不定芽。

1.2.4 培養(yǎng)條件及計(jì)算方法［13-14］

接種后的各處理放在組織培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)溫度25℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，每天照明14 h，接種的分化苗每3周轉(zhuǎn)接1次，20 d后觀察葉片的分化情況、分化時(shí)間及分化數(shù)量。培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)分化的葉片數(shù)和分化的不定芽數(shù)，計(jì)算平均分化芽和不定芽分化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽分化培養(yǎng)基的確定

隨著葉片培養(yǎng)時(shí)間的增加，先在葉片的剪切口處開(kāi)始膨大，形成嫩綠色的瘤狀愈傷組織，之后變成暗紅色，約27 d后在愈傷組織處分化出不定芽。從表1可以看出，歐美楊111號(hào)葉片平均分化芽2.6～22.8個(gè)，不定芽分化率20.00%～96.67%，其中7、10、11、12、13號(hào)的不定芽分化率高于其他，10號(hào)最高為96.67%。芽長(zhǎng)勢(shì)見(jiàn)圖1。

表1 歐美楊111號(hào)葉片在不同培養(yǎng)基上的分化情況

同時(shí)采用相同的方法對(duì)葉柄分化培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，結(jié)果與葉片相同，只是葉柄開(kāi)始分化時(shí)間早于葉片5 d左右。

因此確定歐美楊111號(hào)葉片不定芽最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂6 g·L-1，pH值6.5。

2.2 不定芽生根培養(yǎng)基的確定

10 d左右在莖的基部開(kāi)始膨大，之后長(zhǎng)出小根，初為紅色，隨著根的伸長(zhǎng)變成淺紅、乳白色，培養(yǎng)到20 d左右計(jì)算生根率。由表2可知，不定芽培養(yǎng)15 d左右開(kāi)始生根，生根的不定芽數(shù)18～24個(gè)，生根率75%～100%。其中3號(hào)的生根率最高為100%，平均生根數(shù)為13.2條。因此確定歐美楊111號(hào)不定芽最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂6.0 g·L-1，pH值6.0。

圖1 歐美楊111號(hào)葉片在分化培養(yǎng)基上分化及不定芽的生長(zhǎng)狀況

表2 歐美楊111號(hào)不定芽在不同培養(yǎng)基上的生根情況

3 結(jié)論與討論

3.1 外植體的選擇

同一植株上不同器官的再生能力有所不同，即使同一器官的不同部位，再生能力也有差異［15］。本試驗(yàn)采用葉片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)再生體系的建立，同時(shí)也剪取了葉柄和葉芽為外植體，葉柄的分化要早于葉片，但在分化后期基本相同。葉芽為外植體幾乎未分化。

3.2 外植體的預(yù)處理

對(duì)大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，挑選新生的幼葉、葉柄或莖尖做為外植體，必須根據(jù)剪材時(shí)間、材料的幼嫩程度等選擇消毒劑。本文采用75%的乙醇溶液和0.1%的氯化汞作為消毒劑，并在無(wú)菌的條件下進(jìn)行清洗和消毒，降低了外植體在接種培養(yǎng)過(guò)程中的感染率。

3.3 不同激素對(duì)楊樹(shù)不定芽分化及生根的影響

植物愈傷組織不定芽的分化直接取決于培養(yǎng)基的種類、添加激素的種類與濃度。常用的林木組織培養(yǎng)培養(yǎng)基有MS、WPM和GMS，用的最多的是MS培養(yǎng)基。楊樹(shù)組織培養(yǎng)中常用的有生長(zhǎng)素（IAA、NAA、IBA和2，4-D）和細(xì)胞分裂素（KT、6-BA、ZT、2ip、BAP）。本試驗(yàn)用6-BA、NAA來(lái)誘導(dǎo)歐美楊111不定芽的分化，其最適分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂6 g·L-1，pH值6.5。用IBA誘導(dǎo)生根，其最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.3m g·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂6 g·L-1，pH值6.0。不定芽分化率96.67%，平均分化芽22.8個(gè)，全部生根，平均根數(shù)13.2條。

本研究以歐美楊111號(hào)為試驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、濃度等的研究，建立起組織培養(yǎng)再生體系，為該楊樹(shù)在全國(guó)范圍內(nèi)推廣提供了前提基礎(chǔ)，也為基因工程育種的研究提供了基本條件和保障。

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（責(zé)任編輯：張素清）

Establishment of tissue culture regeneration system of Populus euramericana‘Bellotto’

JIAO Liman
（LiaoningProvincialInstituteofPopulus，Gaizhou115200，China）

In order to establish plant regeneration system of Populus euramericana‘Bellotto’by tissue culture，leaves of P.euramericana‘Bellotto’were used as explants，MS and 1/2MS were used as basic culture medium，which added with different concentrations of NAA，6-BAand IBA，and the adventitious bud induction and rooting situations were observed.Results showed that:the optimum medium for adventitious bud differentiation was MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+sucrose 25.0 mg·L-1+agar 6.0 mg·L-1，pH 6.5；the optimum medium for rooting was1/2MS+IBA0.3 mg·L-1+sucrose 20.0 mg·L-1+agar 6.0 mg·L-1，pH 6.0.

Populus euramericana‘Bellotto’；tissue culture；regeneration system；explant

S722.37

A

1001-1714（2017）01-0015-04

2016-11-06

矯麗曼（1981-），女，工程師，主要從事楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因育種和森林保護(hù)等方面研究。E-mail：jiaoliman1025@163.com。