熱激處理羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)增強(qiáng)其抗逆性的研究

楊 帆,鄒 容

(重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,重慶 402160)

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熱激處理羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)增強(qiáng)其抗逆性的研究

楊 帆,鄒 容

(重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,重慶 402160)

為了研究熱激對益生菌抗逆性的影響,本研究以羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)為實(shí)驗(yàn)對象,以存活率、抗性基因表達(dá)為指標(biāo),采用平板計(jì)數(shù)法研究了熱激處理對羅伊氏乳桿菌在后續(xù)高溫和高鹽逆境下存活率提高的效果,并用qPCR方法檢測基因表達(dá)水平。結(jié)果表明:熱激預(yù)處理(40 ℃,30 min)羅伊氏乳桿菌之后,能顯著(p<0.05)提高其在后續(xù)高溫(45、48、51 ℃),高鹽(0.1%、0.3%、0.7% NaCl,m/v)以及氧化逆境(H2O2,0.3、0.6、1.2 mmol/L)下的存活率。此外,熱激預(yù)處理(40 ℃,30 min)還能顯著(p<0.05)提高巰基過氧化物酶(thiol peroxidase)和抗氧化蛋白(peroxiredoxin)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。說明熱激處理通過提高羅伊氏乳桿菌抗逆基因的表達(dá),增強(qiáng)其對于后續(xù)逆境的抗性。該研究結(jié)果為益生菌的規(guī)?；瘧?yīng)用提供了理論依據(jù)。

羅伊氏乳桿菌,抗逆性,基因表達(dá),存活率,熱激處理

隨著抗生素在飼料中長期大量使用,其引發(fā)的微生物耐藥性、食品安全和環(huán)境污染問題越來越受到人們的重視。益生菌是定植于宿主腸道系統(tǒng)內(nèi),能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的一類有益微生物,作為新型安全高效的飼料添加劑替代抗生素[1]。乳酸菌是益生菌的重要類群,羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)為革蘭氏陽性細(xì)菌,存在于多種鳥類和哺乳動(dòng)物腸道內(nèi),是國際公認(rèn)的新型益生乳酸桿菌,具有較大理論研究和應(yīng)用研究價(jià)值[2-3]。

然而,乳桿菌在作為飼料添加劑應(yīng)用的過程中,會(huì)受到各種環(huán)境逆境(如高溫、低溫、高鹽、氧化、酸脅迫等)的影響,從而影響其活力和有益功能[4-8]。然而,目前關(guān)于增強(qiáng)羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)抗逆性的研究尚未見報(bào)道。為了充分發(fā)揮其作為飼料添加劑的應(yīng)用前景,利用環(huán)保高效、操作簡單的方法增強(qiáng)羅伊氏乳桿菌的抗逆性,本實(shí)驗(yàn)采用物理方法-熱激預(yù)處理(40 ℃,30 min)羅伊氏乳桿菌之后,對其在后續(xù)高溫、高鹽以及氧化逆境的抗逆性做了研究。并在分子水平檢測熱激預(yù)處理對巰基過氧化物酶(thiol peroxidase)和抗氧化蛋白(peroxiredoxin)的表達(dá)水平的影響。該研究結(jié)果將為羅伊氏乳桿菌的規(guī)?；瘧?yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表1 抗逆基因和內(nèi)參基因RT-qPCR擴(kuò)增的引物序列Table 1 Primers of anti-stress and reference genes for RT-qPCR amplification

羅伊氏乳桿菌(L.reuteriCICC 6128) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,是分離于雞腸內(nèi)的益生菌株;EasyPure RNA提取試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司;SuperScript III Platinum SYBR Green一步法 RT-qPCR 試劑盒 美國Invitrogen公司;胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、H2O2國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HH-4Y型電熱恒溫水浴鍋 上海啟前電子科技有限公司;ABI Step One Plus型qPCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 乳桿菌菌株及熱激處理

羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)含有20 mL的LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,1 L無菌水,pH7.0)的50 mL錐形瓶內(nèi),37 ℃ 下,以200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)16 h,使其OD值達(dá)到0.3左右。離心(5000×g,4 ℃,1 min)去掉培養(yǎng)基,然后將菌體重新懸浮于無菌水中,菌體濃度調(diào)OD值為1.0。之后將5 mL的OD值為1.0的L.reuteri懸浮液置于20 mL的錐形瓶中。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,熱激處理?xiàng)l件定為:40 ℃水浴熱激處理30 min。未經(jīng)過水浴熱激處理的菌體作為對照。

1.3 逆境下存活率檢測

將上述經(jīng)過熱激預(yù)處理(40 ℃,30 min)和未經(jīng)過熱激處理的羅伊氏乳桿菌分別置于后續(xù)高溫(45、48、51 ℃水浴),高鹽(0.1%、0.3%、0.7%,m/v的NaCl溶液)以及氧化逆境(0.3、0.6、1.2 mmol/L的H2O2溶液)下處理30 min。然后將菌液梯度濃度稀釋,均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃下培養(yǎng)2 d。

將同一濃度梯度下的菌液均分為兩等份,一份在逆境處理前涂布于LB固體培養(yǎng)基上,另一份在逆境處理后涂布于LB固體培養(yǎng)基上。按照上述條件培養(yǎng),計(jì)數(shù)在培養(yǎng)基上生長出菌落數(shù)CFU,計(jì)算存活率。存活率用逆境處理前與處理后的菌體CFU比值(%)表示[9]。

1.4 抗逆基因的表達(dá)檢測

羅伊氏乳桿菌在各個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)的RNA提取,DNase處理和純化使用的是EasyPure RNA提取試劑盒,步驟根據(jù)試劑盒提供的方案進(jìn)行。純化后的40 ng RNA用于RT-qPCR的分析,每個(gè)反應(yīng)所用的引物是20 pmol,所用熒光染料和試劑盒為SuperScript III Platinum SYBR Green一步法RT-qPCR試劑盒,所用qPCR儀器的程序參數(shù)設(shè)置如下:cDNA合成48 ℃,30 min;變性95 ℃,5 min;60 ℃,20 s之后進(jìn)行40個(gè)循環(huán),95 ℃,5 s;95 ℃,15 s;60 ℃,1 min。以16S rRNA為內(nèi)參基因[10-11],2-ΔΔCt的方法[12]表示目的基因巰基過氧化物酶(thiol peroxidase)和抗氧化蛋白(peroxiredoxin)的相對表達(dá)量(最新的研究報(bào)道在其它細(xì)菌中表明這兩個(gè)基因參與抗逆應(yīng)答[13-14],并且在羅伊氏乳桿菌中兩者核酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中已公開,因此本研究選擇檢查這兩個(gè)抗逆基因的表達(dá))。引物序列參見表1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行,采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用T檢驗(yàn)分析差異,以p<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱激處理對羅伊氏乳桿菌后續(xù)高溫耐受性的影響

熱激預(yù)處理(40 ℃,30 min)之后,將羅伊氏乳桿菌置于后續(xù)的高溫、高鹽和氧化逆境,分析比較熱激預(yù)處理組和未熱激對照組羅伊氏乳桿菌在上述逆境下的存活率。如圖1所示,高溫(45、48、51 ℃)下處理羅伊氏乳桿菌在半個(gè)小時(shí),會(huì)導(dǎo)致其存活率下降。隨著溫度的提高,其存活率下降。然而,熱激預(yù)處理組的羅伊氏乳桿菌在上述各個(gè)高溫處理下的存活率均顯著高于對照組(p<0.05),說明熱激預(yù)處理可增強(qiáng)羅伊氏乳桿菌的抗熱性,其原因可能在于熱激預(yù)處理激活了細(xì)胞中的抗逆應(yīng)答防御,對后續(xù)更高的熱脅迫產(chǎn)生抗性。

圖1 熱激和對照組羅伊氏乳桿菌在后續(xù)高溫下的存活率Fig.1 The survival of heat-shocked and control L. reuteri under the subsequent high temperature注:同一溫度下,字母不同表示差異顯著, p<0.05。圖2、圖3同。

2.2 熱激處理對羅伊氏乳桿菌后續(xù)高鹽耐受性的影響

如圖2所示,高鹽(0.1%、0.3%和0.7% NaCl,w/v)處理羅伊氏乳桿菌半個(gè)小時(shí),會(huì)導(dǎo)致其存活率下降。隨著鹽濃度的提高,其存活率下降越顯著。然而,熱激預(yù)處理組的羅伊氏乳桿菌上述各個(gè)高鹽濃度下的存活率均顯著高于對照組(p<0.05),說明熱激預(yù)處理可增強(qiáng)羅伊氏乳桿菌的耐鹽性。其原因可能在于熱激預(yù)處理激活了細(xì)胞中的抗逆應(yīng)答防御,對后續(xù)的高鹽脅迫產(chǎn)生交互保護(hù)。

圖2 熱激和對照組羅伊氏乳桿菌在后續(xù)高鹽下的存活率Fig.2 The survival of heat-shocked and control L. reuteri under the subsequent salt stress

2.3 熱激處理對羅伊氏乳桿菌后續(xù)氧化耐受性的影響

如圖3所示,氧化逆境(0.3、0.6、1.2 mmol/L H2O2)下處理羅伊氏乳桿菌在30 min,會(huì)導(dǎo)致其存活率下降。隨著鹽濃度的提高,其存活率下降越顯著(p<0.05)。然而,熱激預(yù)處理組的羅伊氏乳桿菌上述各個(gè)H2O2濃度下的存活率均顯著高于對照組(p<0.05),說明熱激預(yù)處理可增強(qiáng)羅伊氏乳桿菌的抗氧化性。其原因可能在于熱激預(yù)處理激活了細(xì)胞中的抗逆應(yīng)答防御,對后續(xù)的氧化脅迫產(chǎn)生交互保護(hù)。針對上述熱激增強(qiáng)羅伊氏乳桿菌對后續(xù)高溫、高鹽和氧化耐受性的表型,筆者推測熱激激活了細(xì)菌細(xì)胞中的特定抗性基因,于是進(jìn)行了下一步抗性基因表達(dá)的檢測。

圖3 熱激和對照組羅伊氏乳桿菌在后續(xù)氧化逆境下的存活率Fig.3 The survival of heat-shocked and control L. reuteri under the subsequent oxidative stress

2.4 熱激處理對羅伊氏乳桿菌抗逆基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步研究熱激處理提高羅伊氏乳桿菌抗逆性的機(jī)理,分別選取了適中的逆境(48 ℃、0.3% NaCl和0.6 mmol/L H2O2)檢測熱激預(yù)處理對抗逆相關(guān)的巰基過氧化物酶(thiol peroxidase)和抗氧化蛋白(peroxiredoxin)在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響。巰基過氧化物酶(thiol peroxidase)在模式微生物釀酒酵母中可作為H2O2受體及氧化還原傳導(dǎo)因子,在抗逆中起著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[15];在藍(lán)細(xì)菌中過量表達(dá)抗氧化蛋白(peroxiredoxin)可清除細(xì)胞中的活性氧(ROS),從而提高細(xì)菌的抗氧化能力[16]。本研究中,如圖4所示,熱激預(yù)處理組的羅伊氏乳桿菌上述各個(gè)所測逆境下巰基過氧化物酶(圖4A)和抗氧化蛋白(圖4B)的基因表達(dá)均顯著高于對照組(p<0.05)。圖5顯示的是相對應(yīng)的巰基過氧化物酶(圖5A)和抗氧化蛋白(圖5B)的qPCR擴(kuò)增曲線圖。

圖4 熱激和對照組羅伊氏乳桿菌在后續(xù)逆境下巰基過氧化物酶(A)和抗氧化蛋白(B)的基因表達(dá)Fig.4 The gene expression of thiol peroxidase(A) and peroxiredoxin(B)in heat-shocked and control L. reuteri under the subsequent stresses

圖5 巰基過氧化物酶(A)和抗氧化蛋白(B)的qPCR擴(kuò)增曲線圖Fig.5 The qPCR amplification curve of thiol peroxidase(A)and peroxiredoxin(B)

3 結(jié)論

最新的研究表明巰基過氧化物酶(thiol peroxidase)和抗氧化蛋白(peroxiredoxin)在微生物對抗性應(yīng)答的過程中起著關(guān)鍵作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)熱激預(yù)處理作為簡便環(huán)保的方法,可以提高羅伊氏乳桿菌中這兩個(gè)抗逆相關(guān)基因的表達(dá),從而增強(qiáng)對后續(xù)高溫、高鹽和氧化逆境的耐受性。此研究成果對于增強(qiáng)羅伊氏乳桿菌抗性,從而更好地應(yīng)用于飼料添加劑提供了有效方法和理論基礎(chǔ)。熱激處理能否增強(qiáng)其他益生菌的抗逆性將會(huì)進(jìn)一步深入研究。

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Improvement of stress tolerance ofLactobacillusreuteriby heat shock

YANG Fan,ZOU Rong

(Chongqing University of Arts and Sciences,College of Forestry & Life Science,Chongqing 402160,China)

In order to assay the effect of heat shock(HS)on the stress tolerance of the probiotic bacterium,Lactobacillusreuteriserves as the research objective in this study. The survival and gene expression ofL.reuteriunder stress condition has been determined via CFU counting method and qPCR analysis. The results showed that the HS pretreatment(40 ℃,30 min)significantly(p<0.05)increased the survival ofL.reuteriunder the subsequent heat stress(45,48,51 ℃),salt stress(0.1%,0.3%,0.7%,m/v)and oxidative stress(0.3,0.6,1.2 mmol/L),respectively. In addition,the HS pretreatment(40 ℃,30 min)markedly enhanced the transcriptional expression of thiol peroxidase and peroxiredoxin. It suggested that HS pretreatment could improve stress tolerance via increasing the expression of anti-stress genes. These results provide a theoretical basis for the large-scale application of probiotics.

Lactobacillusreuteri;stress tolerance;gene expression;survival;heat shock

2016-12-02

楊帆(1963-),男,碩士，教授,研究方向:益生菌的開發(fā)與利用,E-mail:yfan4103@163.com。

TS201.3

A

1002-0306(2017)11-0173-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.024