乳酸菌氧化鋯珠破壁方法的優(yōu)化及適用性研究

潘榮榮,王茂鵬,李 昌,邸 洋,榮鳳君,杜壽文,朱羿龍,劉立明,朱國強,金寧一，*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院,江蘇揚州 225009;2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所,省部共建吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室,吉林長春 130122;3.溫州大學病毒病研究所,浙江溫州 325035)

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乳酸菌氧化鋯珠破壁方法的優(yōu)化及適用性研究

潘榮榮1,2,王茂鵬2+,李 昌2,3,邸 洋2,榮鳳君2,杜壽文2,朱羿龍2,劉立明3,朱國強1，*,金寧一2,3，*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院,江蘇揚州 225009;2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所,省部共建吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室,吉林長春 130122;3.溫州大學病毒病研究所,浙江溫州 325035)

本實驗旨在優(yōu)化氧化鋯珠破壁方法,以期篩選出較佳的破壁條件,提高蛋白得率。實驗在菌體重量、研磨buffer和研磨時間這3方面對該破壁方法進行了優(yōu)化,并通過SDS-PAGE來分析其破壁效果。在優(yōu)化后的條件下,同時對6株乳酸菌進行破壁處理并通過SDS-PAGE來分析其破壁效果。結(jié)果表明:在菌體重量、研磨buffer、鋯珠三者的加入比例(W/V/W)為0.013 g∶300 μL∶1 g的條件下,研磨15 min,提取的蛋白圖譜條帶清晰,豐度高;RIPA、PBS、PENP、GUS作為研磨buffer時,提取的蛋白圖譜條帶清晰且豐度高,而8 mol/L尿素作為研磨buffer時,圖譜條帶模糊且豐度低;6株乳酸菌經(jīng)該方法破壁處理后,蛋白圖譜條帶均具有較高的豐度和清晰度。因此,對于乳酸菌的破壁,氧化鋯珠破壁法具有快速、高效的優(yōu)點。

乳酸菌,氧化鋯珠,優(yōu)化,適用性

細胞破壁方法很多:生物法,如酶溶法;化學法,如酸熱法;物理法,如反復凍融法、超聲破壁法、機械法和微波法等,各有優(yōu)缺點[1-3]。我們需要根據(jù)細胞的結(jié)構(gòu)和化學組成選擇合適的破壁方法[4]。革蘭氏陽性菌,具有厚而致密的剛性細胞壁,破壁較困難,目前對于革蘭氏陽性菌的破壁,已有較多文獻報道,如:胡桂萍等[5]利用玻璃珠破碎芽胞桿菌細胞壁提取蛋白;趙春燕等[6]利用溶菌酶破碎乳酸菌細胞壁提取菌體蛋白;孫慧慧等[7]通過改良的 CTAB法破碎節(jié)桿菌細胞壁提取基因組DNA;鄒曉蕾等[8]采用Triton X-100法提取嗜鹽四聯(lián)球菌總RNA。近年來,氧化鋯珠破壁法以其快速、高效、經(jīng)濟的特點而被廣泛應用[9]。該方法可以在短時間內(nèi)破碎裂解樣品且研磨過程中產(chǎn)生的熱量少,可以最大限度的避免核酸的降解和蛋白的變性。此外,氧化鋯珠具有以下特點:極低的(ppm級)磨耗(耐磨性是玻璃珠的30～50倍);極高的硬度;極高的密度(能有效提高研磨效率);耐高溫耐腐蝕;可以多次重復使用,使用成本低[9-11];氧化鋯珠破壁法是一種快速、高效、經(jīng)濟、高通量的破壁方法。

目前,關(guān)于利用氧化鋯珠破碎乳酸菌細胞壁的報道主要集中在國外[12-14],但在國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)在菌體重量、研磨buffer、研磨時間這3方面對氧化鋯珠破壁方法進行優(yōu)化的研究。

乳酸菌是指一類可發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性球菌或桿菌的統(tǒng)稱,它們的形態(tài)、代謝性能和生理學特征不完全相同[15],每一種菌體由于其各自特點不同,經(jīng)同一種破壁方法處理后,可能產(chǎn)生的破壁效果就具有較大差異[16]。因此,本文還探究了氧化鋯珠破壁方法對6株乳酸菌破壁的適用性,以期探索出一種更快速、更高效、更經(jīng)濟、通用的乳酸菌破壁方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

副干酪乳桿菌(L.caseisubsp.casei20296)、唾液乳桿菌(L.salivariussubsp.salicinius23174) CICC;德氏乳桿菌(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus1.2161)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus1.1878)、植物乳桿菌(L.plantarum1.557)、乳酸乳球菌(NZ3900) CGMCC;MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基 青島高科園海博生物方法有限公司。

MCO-18M型CO2恒溫培養(yǎng)箱 日本SANYO公司;BSIII型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;5417R小型臺式高速離心機 德國eppendorf公司;Tissue Lyser II 組織研磨儀 德國QIAGEN公司;0.1μm氧化鋯 珠河源帝諾新材料有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳桿菌的培養(yǎng)與收集 無菌條件下接一環(huán)保藏菌種在MRS固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng) 24 h,長出單克隆后,挑取單個菌落在MRS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)劃線培養(yǎng),如此連續(xù)傳兩代[17]。將MRS平板培養(yǎng)基上新鮮活化的單菌落挑至5 mL MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃厭氧條件下靜置培養(yǎng)12 h[18-19]。12000 r/min,離心1 min,收集菌體。用1 mL預冷的洗滌液(100 mmol/L磷酸緩沖液,10 mmol/L EDTA)洗滌菌體,洗滌3次,再用PBS洗滌3次,12000 r/min離心1 min,收集菌體。

1.2.2 乳酸乳球菌的培養(yǎng)與收集 無菌條件下接一環(huán)保藏菌種在M17固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),30 ℃培養(yǎng) 24 h,長出單克隆后,挑取單個菌落在M17固體培養(yǎng)基上繼續(xù)劃線培養(yǎng),如此連續(xù)傳兩代。將乳酸乳球菌的M17平板培養(yǎng)基上新鮮活化的單菌落挑至5 mL GM17液體培養(yǎng)基,30 ℃厭氧條件下靜置培養(yǎng)12 h[20-21]。12000 r/min,離心1 min,收集菌體。用1 mL預冷的洗滌液(100 mmol/L磷酸緩沖液,10 mmol/L EDTA)洗滌菌體,洗滌3次,再用PBS洗滌3次,12000 r/min離心1 min,收集菌體。

1.2.3 氧化鋯珠的前處理 用5.8 mol/L HCl覆蓋氧化鋯磨介,室溫振蕩處理過夜。棄上清,加入滅菌水清洗(每次清洗都要反復振蕩),共洗10次。最后,放入平皿中鋪散開,75 ℃烘干備用[14]。

1.2.4 氧化鋯珠法破壁 按照方法1.2.1培養(yǎng)與收集1 mL菌液,加入300 μL預冷的研磨buffer并重懸菌體,再加入1 g預冷的氧化鋯珠,然后,放入組織研磨儀中振蕩研磨(振蕩頻率為30次),研磨20 min。研磨結(jié)束后,用1 mL注射器在研磨后的離心管底部扎一個小孔,并將扎孔的離心管立即放入另一新的預冷的1.5 mL離心管,4 ℃,5000 r/min,離心5 min,收集研磨后蛋白上清[14]。

1.2.5 氧化鋯珠破壁條件的參數(shù)選擇及實驗設(shè)計 選擇氧化鋯珠破壁的3個主要條件:菌體重量、研磨buffer、氧化鋯珠三者的加入比例(W/V/W)、研磨buffer和研磨時間,并確定各條件的水平范圍[6,22]。

1.2.5.1 優(yōu)化菌體重量的實驗設(shè)計 在固定研磨buffer為RIPA裂解液,加入體積為300 μL,氧化鋯珠加入量為1 g,研磨時間為20 min的條件下,菌體重量選取0.0173,0.0132,0.0084,0.0043 g,考察菌體重量對乳酸菌破壁效果的影響。

1.2.5.2 優(yōu)化研磨時間的實驗設(shè)計 在固定研磨buffer為RIPA裂解液,加入體積為300 μL,氧化鋯珠加入量為1 g,菌體重量為0.013 g的條件下,研磨時間選取5,10,15,20,25 min,考察研磨時間對乳酸菌破壁效果的影響。

1.2.5.3 優(yōu)化研磨buffer的實驗設(shè)計 在固定研磨buffer加入體積為300 μL,氧化鋯珠加入量為1 g,菌體重量為0.013 g,研磨時間為20 min的條件下,研磨buffer選取:RIPA裂解液(強)(pH7.4);PBS(pH7.4);PENP(pH=7,10 mmol/L磷酸三鉀、10 mmol/L EDTA、50 mmol/L、NaCl 1 mmol/L PMSF);GUS(pH=7，50 mmol/L磷酸緩沖液、10 mmol/Lβ-巰基乙醇、1 mmol/L EDTA、0.1% TritonX-100);8 mol/L尿素(pH=7.4);考察研磨buffer對乳酸菌破壁效果的影響。

1.2.5.4 SDS-PAGE檢測乳酸菌破壁效果 從收集的蛋白上清中各取50 μL,直接加入12.5μL 5×SDS 樣品緩沖液,充分混勻,煮沸5 min,各取15 μL煮沸后樣品進行12% SDS-PAGE分析。

1.2.6 氧化鋯珠破壁法對于乳酸菌破壁的適用性研究

1.2.6.1 6株乳酸菌菌壁的破碎 分別稱取6管重量相同的不同菌體(副干酪乳桿菌,德氏乳桿菌,嗜酸乳桿菌,唾液乳桿菌,植物乳桿菌,乳酸乳球菌)。接下來按照方法1.2.4進行氧化鋯珠研磨,收集上清。

1.2.6.2 SDS-PAGE檢測6株乳酸菌破壁效果 從收集的蛋白上清中各取50 μL,離心后取上清,直接加入12.5 μL 5×SDS 樣品緩沖液,充分混勻,煮沸5 min,各取15 μL煮沸后樣品進行12% SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化鋯珠破壁條件的優(yōu)化

由圖1可知,在研磨buffer、鋯珠的加入量分別為300 μL、1 g,研磨buffer為RIPA的條件下時,隨著菌體重量的增加,SDS-PAGE蛋白圖譜條帶數(shù)目越來越多且清晰度越來越高,但當菌體重量達到0.0132 g時,即使再增加菌體重量,蛋白圖譜條帶的豐度以及清晰度也基本上不再變化。說明0.0132 g菌體已達到該研磨體系的最大值,若要增加研磨菌量,則必須相應增加研磨buffer、鋯珠的加入量,此外,從蛋白圖譜條帶的豐度來看,菌體蛋白釋放較完全。所以菌體重量、研磨buffer以及氧化鋯珠三者的加入比例(W/V/W)為0.013 g∶300 μL∶1 g較佳。

圖1 菌體重量的優(yōu)化Fig.1 Optimization of cell weight注：1～4:0.0173、0.0132、0.0084、0.0043 g菌體加入量，M：(14～100 kDa)Protein Marker。

由圖2可知,在菌體重量、研磨buffer以及氧化鋯珠三者的加入比例(w/v/w)一定,研磨buffer為RIPA的條件下,隨著研磨時間的延長,SDS-PAGE蛋白圖譜條帶數(shù)目越來越多且清晰度越來越高,但當研磨時間達到15 min時,即使再增加研磨時間,蛋白圖譜條帶的豐度以及清晰度也基本上不再變化。說明在該研磨體系,研磨15 min,已可以較完全破碎菌體。所以在菌體重量、研磨buffer(RIPA)以及氧化鋯珠三者的加入比例(w/v/w)為0.013 g∶300 μL∶1 g時,研磨15 min較佳。

圖2 研磨時間的優(yōu)化Fig.2 Optimization of grinding time注：1～6：0、5、10、15、20、25 min；M：(14～100 kDa)Protein Marker。

由圖3可知,在菌體重量、研磨buffer以及氧化鋯珠三者的加入比例(w/v/w)為0.013 g∶300 μL∶1 g,研磨時間為15 min的條件下,8 mol/L尿素作為研磨buffer時,蛋白圖譜條帶模糊且豐度低,菌體蛋白釋放不完全。而其余四種(RIPA,PBS,PENP,GUS)作為研磨buffer時,蛋白圖譜條帶清晰且豐度高,菌體蛋白釋放較完全。圖中也可看出這四種buffer的研磨效果相差不大。所以除8 mol/L尿素外，其余四種(RIPA,PBS,PENP,GUS)作為研磨buffer都較適宜。

圖3 研磨buffer的優(yōu)化Fig.3 Optimization of grinding buffer注：1～5:RIPA、PBS、PENP、GUS、Urea；M：(14～100 kDa)Protein Marker。

綜上研究結(jié)果,在菌體重量、研磨buffer以及氧化鋯珠三者的加入比例(w/v/w)為0.013 g∶300 μL∶1 g,研磨buffer為RIPA、PBS、PENP、GUS中的任意一種的條件下,研磨時間為15 min,破壁效果較佳。

2.2 氧化鋯珠破壁法對于乳酸菌破壁的適用性研究

由圖4,圖5可知,6株乳酸菌經(jīng)氧化鋯珠破壁后,SDS-PAGE蛋白圖譜條帶均具有較高的豐度和清晰度,在14～100 kDa都有比較清晰的條帶,說明菌體蛋白均收獲較完全。因此,對于乳酸菌的破壁,氧化鋯珠破壁法具有較好的適用性。

圖4 5株乳桿菌破壁的SDS-PAGE效果圖Fig.4 SDS-PAGE rendering of five strains of lactobacillus wall-breaking注：1：副干酪乳桿菌，2：德氏乳桿菌，3：嗜酸乳桿菌，4：唾液乳桿菌，5：植物乳桿菌(Lp WCFS1)；M：(14～100 kDa)Protein Marker。

圖5 乳球菌破壁的SDS-PAGE效果圖Fig.5 SDS-PAGE rendering of lactococcus wall-breaking注：1,2-乳酸乳球菌；M：(14～100 kDa)Protein Marker。

3 討論

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是能發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細菌的通稱,主要包括腸球菌、乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、鏈球菌及雙歧桿菌等。大多數(shù)乳球菌和乳桿菌是公認的食品級的微生物[23]。其內(nèi)源蛋白以及其他非分泌性代謝產(chǎn)物廣泛應用于食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域[24-25]。但由于破壁困難,限制了部分應用。因此,尋找一種有效的破除乳酸菌細胞壁的方法,能擴展乳酸菌等食品微生物在食品工業(yè)中的應用。氧化鋯銖破壁提供了一種有效的手段,但是影響破壁效果的因素較多,需要進行優(yōu)化。

本實驗在菌體重量、研磨buffer、氧化鋯珠三者的加入比例(w/v/w)、研磨buffer的選擇、研磨時間這3方面對氧化鋯珠破壁條件進行了優(yōu)化。從研磨buffer的優(yōu)化結(jié)果來看,RIPA、PBS、PENP、GUS這四種buffer都較適宜作為研磨buffer,選擇PENP作為研磨buffer,所提取的蛋白可以用于DNA體外修飾[12],選擇GUS作為研磨buffer,所提取的蛋白可以用于GUS酶活力的測定[13],若所提取的蛋白用于SDS-PAGE分析,Western-blot分析,可以選擇成本較低,配制方便的PBS作為研磨buffer,也可選擇購買商品化的RIPA裂解液。從研磨時間的優(yōu)化結(jié)果來看,氧化鋯珠破壁法可以在短時間內(nèi)(10～15 min)破碎裂解樣品,說明氧化鋯珠破壁法是一種非?？焖佟⒏咝У钠票诜椒?。

此外,本實驗也驗證了氧化鋯珠破壁法對于乳酸菌的破壁具有良好的適用性,此方法也許能成為一種通用有效的破壁手段。本文通過對氧化鋯珠破壁條件的優(yōu)化,指明了該方法潛在的影響因素,有利于進一步的優(yōu)化研究,使其在食品工業(yè)領(lǐng)域具有工藝放大的可行性,同時也為進一步探索經(jīng)濟、高效的乳酸菌破壁方法提供技術(shù)參考。

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Optimization of zirconia beads wall-breaking method for lactic acid bacteria and study on its effect of the applicability

PAN Rong-rong1,2,WANG Mao-peng2+,LI Chang2,3,DI Yang2,RONG Feng-jun2,DU Shou-wen2, ZHU Yi-long2,LIU Li-ming3,ZHU Guo-qiang1，*,JIN Ning-yi2,3，*

(1.College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China; 2.Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Jilin Province,Institute of Military Veterinary,Academy of Military Medical Sciences,Changchun 130122,China; 3.Institute of Viral Diseases,Wenzhou University,Wenzhou 325035,China)

This study aims to optimize the zirconia beads wall-breaking method,screen out the better broken conditions for breaking lactic acid bacteria cell wall and improve the protein yield.The weight of bacteria,the grinding buffer and time were tested and selected as important aspects to optimize the wall-breaking method,and then,the breaking effect was analyzed and evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE).Under optimized conditions,six different species of strains from lactic acid bacteria were tested for cell wall-breaking treatments with the zirconia beads method,after that,the breaking effects were analyzed and evaluated by SDS-PAGE.Results showed that,on condition that the ratio of bacteria,grinding buffer and zirconia beads(W/V/W)is 0.013 g:300 μL:1 g,grinding time of 15 min,the protein pattern with clear banding,high abundance;RIPA,PBS,PENP,GUS as the grinding buffer,the protein pattern with clear banding,high abundance,while 8 mol/L urea as the grinding buffer,the protein pattern with obscure banding,low abundance. After Six strains of lactic acid bacteria were broken through this method,the protein pattern with clear banding,high abundance.Therefore,zirconia beads method is a combined rapid and efficient method for breaking lactic acid bacteria cell wall.

lactic acid bacteria;zirconia beads;optimization;applicability

2016-11-11 +為并列第一作者

潘榮榮(1989-),女,碩士,研究方向:獸醫(yī)免疫學,E-mail:2281078335@qq.com。 王茂鵬(1987-),男,博士,研究方向:分子免疫學,E-mail:wangmaopeng@126.com。

*通訊作者:朱國強(1964-),男,博士,教授,研究方向:(病原)微生物和(動物)機體的相互作用的分子機理,E-mail:yzgqzhu@yzu.edu.cn。 金寧一(1956-),男,博士,研究方向:分子病毒學與免疫學,E-mail:ningyik@126.com。

國家自然科學基金(31472197);病原微生物生物安全國家重點實驗室開放課題(SKLPBS1435)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)11-0140-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.018