一株乳酸乳球菌的分離鑒定及其發(fā)酵豆汁工藝優(yōu)化

張莉力,韓 梅,劉黎瑩,于 洋,張 振,許云賀

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001;2.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州 121001)

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一株乳酸乳球菌的分離鑒定及其發(fā)酵豆汁工藝優(yōu)化

張莉力1,韓 梅1,劉黎瑩1,于 洋1,張 振1,許云賀2,*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001;2.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州 121001)

本研究從自然發(fā)酵北京豆汁中篩選到一株既可以加速豆汁與淀粉分離又具有優(yōu)良豆汁發(fā)酵性能的乳酸乳球菌乳酸亞種,將其命名為L(zhǎng)actococcuslactissubsp.lactisLLY003。然后以綠豆淀粉的副產(chǎn)物——淀粉上清液為原料,將Lactococcuslactissubsp.lactisLLY003應(yīng)用于豆汁發(fā)酵,通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn),確定了發(fā)酵豆汁的最佳發(fā)酵工藝:在發(fā)酵時(shí)間為6 h,溫度為39 ℃,6%蔗糖添加量和8%接種量的條件發(fā)酵,豆汁的感官評(píng)分達(dá)到94分,乳酸菌活菌數(shù)可以達(dá)到3.22×1011CFU/mL。通過(guò)保質(zhì)期實(shí)驗(yàn),確定發(fā)酵豆汁在4 ℃冷藏條件下,保質(zhì)期至少可達(dá)20 d,在保質(zhì)期內(nèi)每毫升發(fā)酵豆汁的乳酸菌活菌數(shù)在一千億以上。

豆汁,綠豆,乳酸菌,發(fā)酵

老北京豆汁是一種歷史悠久的傳統(tǒng)發(fā)酵食品,以其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)深受北京人的喜愛。豆汁是以綠豆為原料,經(jīng)浸泡、研磨、沉淀、粉漿分離和熬制等工藝得到的一種以酸味為主、摻雜著些許臭味的液體發(fā)酵食品[1-3]。在加工過(guò)程中,綠豆淀粉的分離與發(fā)酵產(chǎn)酸是豆汁加工的關(guān)鍵工序,已有研究表明豆汁中的乳酸菌是加速淀粉沉降與發(fā)酵產(chǎn)酸的主要微生物[4-5],但是目前仍未有適用于豆汁工業(yè)發(fā)酵的菌種,所以豆汁生產(chǎn)仍處于初級(jí)加工階段,產(chǎn)品質(zhì)量受自然條件和操作技術(shù)等影響大[6-8]。為此本實(shí)驗(yàn)以自然發(fā)酵生豆汁為樣品,分別以絮凝率、pH和豆汁發(fā)酵風(fēng)味為指標(biāo),篩選出豆汁中具有絮凝淀粉活性的乳酸菌,將其作為豆汁發(fā)酵菌株應(yīng)用于豆汁純種發(fā)酵,并優(yōu)化發(fā)酵工藝,提高發(fā)酵豆汁的食用安全性和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性,口味更容易被大多數(shù)消費(fèi)者接受,也為實(shí)現(xiàn)發(fā)酵豆汁的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆汁 北京東直門豆汁店、隆福寺小吃店、老磁器口豆汁店,于4 ℃手提冰箱中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室,采樣當(dāng)天進(jìn)行微生物分離;綠豆 市售食用級(jí);蔗糖、葡萄糖、乳糖、酵母膏、磷酸氫二鉀、乙酸鈉 分析純;綠豆上清液 將綠豆浸泡8～12 h,以豆水比(g/mL)1∶15的比例打漿30 s,過(guò)100目篩子,混勻后靜置使淀粉沉淀完全,該上清液即為綠豆淀粉上清液;綠豆汁種子培養(yǎng)基 酵母膏5 g、K2HPO42 g、葡萄糖20 g、蔗糖2 g、乙酸鈉5 g、綠豆上清液1000 mL,調(diào)pH至6.8,121 ℃滅菌20 min;綠豆糖水培養(yǎng)液 蔗糖20 g、綠豆上清液1000 mL。

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái) 上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司;LRH-350F生化培養(yǎng)箱 上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HZQ-F200型振蕩培養(yǎng)箱 上海華鄰實(shí)業(yè)有限公司;DNA快速提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;TG16K-II臺(tái)式高速離心機(jī) 濟(jì)南福的機(jī)械有限公司;PHS-3B精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;UV754PC紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀表有限公司;JYL-Y99料理機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司;OLYMPUS BX53顯微鏡 奧林巴斯(中國(guó))有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豆汁中產(chǎn)酸菌的分離純化 采用10梯度稀釋法將老北京豆汁稀釋至10-7,取10-6、10-7的稀釋液各0.1 mL分別注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中,每個(gè)稀釋度做兩個(gè)重復(fù)。以無(wú)菌操作按20～30 g/L的量將滅菌的CaCO3加入熔化了的綠豆汁種子培養(yǎng)基中,使樣品稀釋液和CaCO3均勻分布于培養(yǎng)基中,于30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取周圍產(chǎn)生CaCO3的溶解圈的典型單菌落分別接種于綠豆汁種子培養(yǎng)液中,置于30 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。取試管液體培養(yǎng)物1環(huán),進(jìn)行涂片、革蘭氏染色,油鏡觀察個(gè)體形態(tài)和純度,同時(shí)挑取1環(huán)培養(yǎng)液與載玻片上的3% H2O2混勻,視產(chǎn)氣泡情況[9]。將革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌且過(guò)氧化氫酶陰性菌株初步鑒定為乳酸菌,分別接種于綠豆汁種子培養(yǎng)基斜面上,30 ℃溫箱中培養(yǎng)48 h后于4 ℃冰箱保存,待下一步篩選。

1.2.2 具有絮凝淀粉活性產(chǎn)酸菌的篩選 從分離到的菌株斜面挑取2環(huán)乳酸菌,接種到3 mL綠豆汁種子培養(yǎng)液中,置于30 ℃培養(yǎng)24 h,再將該培養(yǎng)液按5%接種量擴(kuò)培至綠豆汁種子培養(yǎng)液中,置于30 ℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定發(fā)酵液的絮凝率。

1.2.3 淀粉絮凝率檢測(cè)方法 取2.5 mL未接種綠豆汁培養(yǎng)基,加入裝有25 mL綠豆淀粉乳的25 mL刻度試管中,塞上塞子后上下混勻10次,沉淀3 min,在刻度試管的18 cm處取樣測(cè)定其540 nm處吸光度值(濁度),取值設(shè)為空白值A(chǔ);同樣方法取2.5 mL菌株發(fā)酵液加入裝有25 mL綠豆淀粉乳的25 mL刻度試管中,混勻后在刻度試管的18 cm處取樣測(cè)定其540 nm處吸光度值(濁度),取值設(shè)為B[10-11]。

綠豆淀粉乳:取浸泡8～12 h的綠豆,按1∶15的比例加水打漿,過(guò)120目篩子所得濾液即為綠豆淀粉乳。

式中:A為空白培養(yǎng)基上清的吸光度(濁度);B為樣品上清液的吸光度(濁度)。

1.2.4 豆汁發(fā)酵菌篩選 從具有絮凝活性的菌株斜面挑取3環(huán)菌,接種到2 mL綠豆糖水培養(yǎng)液中,30 ℃培養(yǎng)24 h,再按5%接種量接入到綠豆糖水培養(yǎng)液中發(fā)酵豆汁,30 ℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定發(fā)酵液的pH,并進(jìn)行發(fā)酵豆汁風(fēng)味評(píng)定。

1.2.5 菌種鑒定

1.2.5.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察 將篩選到的菌株接種于綠豆汁種子培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落形態(tài),并進(jìn)行革蘭氏染色,莢膜染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)及分裂后菌體間排布方式。

1.2.5.2 菌株的生理生化鑒定 按照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行菌株的生理生化特性鑒定。

1.2.5.3 菌株16S rDNA序列的測(cè)定與分析 DNA的提取:取菌液2 mL,12000 r/min離心2 min,去上清液收集菌體,用天根DNA試劑盒提取DNA。提取后的基因組DNA作為擴(kuò)增16S rDNA的模板。

16S rDNA 系列擴(kuò)增:兩個(gè)PCR引物分別是:27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R:(5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),引物由上海生工(Sangon)合成。

PCR擴(kuò)增體系:總體積為50 μL,其中27F引物1 μL,1492R引物1 μL,deNTP 1 μL，Pfu Buffer 5 μL,Pfu酶0.25 μL,加水至50 μL。98 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性35 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán)后延伸4 min。PCR產(chǎn)物0.8%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色20 min,紫外分析儀檢測(cè)。PCR產(chǎn)物純化、16S rDNA序列測(cè)定均由上海生工完成。

16S rDNA序列同源性分析:將測(cè)定的16S rDNA序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索,與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。根據(jù)比對(duì)結(jié)果,找出與數(shù)據(jù)庫(kù)同源性最高的已知菌種,推測(cè)待鑒定菌株的可能的屬或種。

1.2.6 豆汁發(fā)酵劑的制備 用接種環(huán)挑取三環(huán)斜面保藏的發(fā)酵菌株于5 mL綠豆糖水培養(yǎng)液中,30 ℃下發(fā)酵24 h后,將這5 mL發(fā)酵液擴(kuò)大培養(yǎng),繼續(xù)接入50 mL綠豆糖水培養(yǎng)液中30 ℃下發(fā)酵24 h,獲得豆汁的發(fā)酵劑。

1.2.7 豆汁發(fā)酵工藝流程 100 g綠豆→清洗→浸泡(豆水比(g/mL)1∶10,8 h)→沖洗→加水2000 mL打漿30 s(豆水比(g/mL)1∶20)→過(guò)濾(100目篩子)→混勻→靜置40 min,按2∶1的比例取上清液和第二層,混勻→加入6%的蔗糖,微加熱使其溶解→滅菌(100 ℃,30 min)→晾涼至20～30 ℃→接入10%的發(fā)酵劑→發(fā)酵(39 ℃,6 h)→冷藏(4 ℃)。

1.2.8 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

1.2.8.1 單因素實(shí)驗(yàn) 分別進(jìn)行接種量(3%、5%、8%、10%、12%、15%)、蔗糖(0%、2%、4%、6%、8%、10%)、培養(yǎng)時(shí)間(2、4、6、8、10、12 h)、培養(yǎng)溫度(31、33、35、37、39、41 ℃)的單因素發(fā)酵實(shí)驗(yàn),其他條件同1.2.7,以感官評(píng)分為指標(biāo),分析各因素對(duì)發(fā)酵的影響。

1.2.8.2 正交實(shí)驗(yàn) 選取時(shí)間、溫度和蔗糖添加量三個(gè)因素,以感官評(píng)分為指標(biāo),作L9(33)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳發(fā)酵工藝條件(表1)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 乳酸菌發(fā)酵液絮凝率、pH及發(fā)酵風(fēng)味Table 3 Flocculating rate,pH and flavor of the fermentation by lactic acid bacteria

注:同行數(shù)據(jù)之間肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

表4 乳酸菌個(gè)體形態(tài)特征Table 4 Individual morphology of lactic acid bacteria

1.2.8.3 感官評(píng)定 感官評(píng)定在錦州醫(yī)科大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室完成,邀請(qǐng)10人組成評(píng)定小組,明確本實(shí)驗(yàn)的目的和意義以及感官評(píng)定的指標(biāo)和注意事項(xiàng)。本實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)雙盲法進(jìn)行檢驗(yàn)(即對(duì)樣品進(jìn)行編號(hào),檢驗(yàn)樣品也隨機(jī)化),旨在減少如個(gè)人嗜好與偏愛、經(jīng)驗(yàn)等因素對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響。評(píng)定分?jǐn)?shù)采用 3 個(gè)分制,分別對(duì)不同的情況進(jìn)行打分。每名成員單獨(dú)進(jìn)行評(píng)分,不互相交流,評(píng)定下一個(gè)樣品之前要用清水漱口。取10名成員的平均分作為最后的結(jié)果。發(fā)酵豆汁感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)詳見表2。

表2 發(fā)酵豆汁感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of fermented beverage of mung bean

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 原始數(shù)據(jù)采用Excel 2007整理,采用SPSS 19.0 進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及LSD多重檢驗(yàn)(p<0.05),數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆汁發(fā)酵菌株篩選

淀粉的分離與發(fā)酵產(chǎn)酸是加工豆汁的關(guān)鍵工序,因此本研究以檢測(cè)淀粉沉降分離速度的絮凝率、發(fā)酵產(chǎn)酸的pH和豆汁發(fā)酵風(fēng)味為指標(biāo)篩選豆汁發(fā)酵菌株。分別從三個(gè)不同來(lái)源的老北京豆汁樣品中共選取56株有碳酸鈣溶解圈的產(chǎn)酸菌株,其中革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性的菌株有16株,初步鑒定為乳酸菌;然后分別測(cè)定這16株菌發(fā)酵液的絮凝率,有8株菌的絮凝率高于50%,結(jié)果見表3,其中3株為球狀乳酸菌、5株為桿狀乳酸菌,而且不論是桿狀產(chǎn)酸菌還是球狀產(chǎn)酸菌菌體分裂后的排布方式均為鏈狀(表4)。

將上述具有絮凝活性的乳酸菌接入到綠豆糖水培養(yǎng)液中發(fā)酵豆汁,30 ℃培養(yǎng)24 h,發(fā)酵液的pH及豆汁風(fēng)味見表3。5株桿狀的乳酸菌發(fā)酵后的豆汁pH都低于4,且發(fā)酵豆汁普遍具有發(fā)酵酸腐味,而3株球菌發(fā)酵后的酸味較柔和,在3株球狀乳酸菌中以LLY003菌株絮凝率最高,即加速淀粉沉降分離速度最快,因此選擇LLY003菌株作為豆汁發(fā)酵菌種,并對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定。

2.2 LLY003菌株的鑒定

2.2.1 LLY003菌株的個(gè)體形態(tài)與菌落形態(tài) LLY003菌株在綠豆汁種子培養(yǎng)基培養(yǎng),30 ℃培養(yǎng)48 h的菌落圖片及菌落特征見圖1和表5。

表5 LLY003菌株的形態(tài)特征Table 5 Individual morphological characters of strain LLY 003

表6 LLY003菌株的菌落形態(tài)特征Table 6 Colonial morphology characters of strain LLY 003

圖1 綠豆汁種子培養(yǎng)基中菌株LLY003菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of strain LLY003 on green bean juice seed solid medium

LLY003菌株在豆汁種子培養(yǎng)基中,30 ℃下培養(yǎng)48 h,觀察菌落大小、形態(tài)和顏色,結(jié)果見圖2和表6。

圖2 菌株LLY003的個(gè)體形態(tài)(×1000)Fig.2 Individual morphology of strain LLY003(×1000)

2.2.2 LLY003的生理生化特征 根據(jù)常規(guī)生理生化鑒定,結(jié)果見表7,參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,初步判斷菌株LLY003為乳球菌屬。

表7 LLY003菌株生理生化特性Table 7 Physiology biochemistry characteristics of strain LLY003

注:+表示陽(yáng)性,-表示陰性。

2.2.3 乳酸菌LHY03的16S rDNA序列分析結(jié)果 該菌株的16S rDNA 序列全長(zhǎng)共1466 bp,經(jīng)Genbank比對(duì)相似性達(dá)到99.8%;通過(guò)菌體的群體形態(tài)觀察、個(gè)體形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果及菌株的16S rDNA序列比對(duì),確定該菌株為乳酸乳球菌乳酸亞種,命名為L(zhǎng)actobacilluslactissubsp.lactisLLY003,已于2016年7月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCC No. 12795。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝實(shí)驗(yàn)

2.3.1 不同接種量對(duì)豆汁發(fā)酵工藝的影響 適當(dāng)提高接種量可以縮短微生物生長(zhǎng)的延滯期,減緩菌株發(fā)酵產(chǎn)酸的速度,由圖3可知,感官評(píng)分隨接種量的增多而不斷增大,當(dāng)接種量達(dá)到8%時(shí),感官評(píng)分達(dá)到最高值92分,之后隨接種量的增加,豆汁感官質(zhì)量差異不顯著,考慮增加接種量會(huì)提高豆汁生產(chǎn)成本,因此選擇8%的接種量。

圖3 接種量對(duì)豆汁發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on the fermentation of mung bean beverage注:小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05),圖4～圖6同。

2.3.2 不同蔗糖添加量對(duì)豆汁發(fā)酵工藝的影響 蔗糖作為碳源,在一定濃度范圍,菌體的生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酸速度隨著蔗糖含量的增加而加快,由圖4可知,蔗糖的添加量在6%～8%時(shí),豆汁發(fā)酵風(fēng)味的感官評(píng)分較高,因?yàn)檎崽呛窟^(guò)高會(huì)增大培養(yǎng)液的滲透壓,抑制菌體生長(zhǎng),另外甜度過(guò)高對(duì)人體健康不利,因此選擇6%的蔗糖添加量。

圖4 蔗糖添加量對(duì)豆汁發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of sucrose on the fermentation of mung bean beverage

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)豆汁發(fā)酵工藝的影響 由圖5可知,發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)豆汁風(fēng)味的影響較大,在6 h之前,感官評(píng)分隨時(shí)間增多而增大,培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短,菌體生長(zhǎng)不充分,乳酸菌發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸量不足,發(fā)酵豆汁偏甜、酸爽感不足。在培養(yǎng)6 h時(shí),感官評(píng)分達(dá)到最高分90分。之后,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)、乳酸菌產(chǎn)酸量增大,酸度增加,影響口感,豆汁感官評(píng)分減小,因此發(fā)酵時(shí)間選擇6 h。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豆汁發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of culture time on the fermentation of mung bean beverage

2.3.4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)豆汁發(fā)酵工藝的影響 由圖6可知,培養(yǎng)溫度低于35 ℃時(shí),隨著溫度的提高,豆汁感官評(píng)分增加,這可能是由于溫度較低時(shí),微生物生長(zhǎng)速率低及發(fā)酵產(chǎn)酸少,風(fēng)味口感欠佳。在35～39 ℃之間,感官評(píng)分緩慢增長(zhǎng),39 ℃時(shí)達(dá)到最高分?jǐn)?shù)93分,之后評(píng)分下降,因此選擇39 ℃作為豆汁的最佳發(fā)酵溫度。

圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵工藝的影響Fig.6 Effect of culture temperature on the fermentation of mung bean beverage

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)表可以看出,對(duì)發(fā)酵影響最大的因素是發(fā)酵時(shí)間,其次是發(fā)酵溫度和蔗糖添加量。根據(jù)結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件組合為A2B3C2。在發(fā)酵時(shí)間為6 h,溫度為39 ℃,蔗糖添加量為6%的條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),感官評(píng)分達(dá)到94分,乳酸菌活菌數(shù)可以達(dá)到3.22×1011CFU/mL。

表8 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of orthogonal experiment

2.5 保質(zhì)期實(shí)驗(yàn)

如表9所示,發(fā)酵豆汁的保質(zhì)期實(shí)驗(yàn)以其pH、乳酸菌活菌數(shù)及感官評(píng)分為檢測(cè)指標(biāo),在實(shí)驗(yàn)期間,豆汁在4 ℃低溫下保藏20 d活菌數(shù)幾乎沒(méi)有下降,pH略有降低,感官質(zhì)量也沒(méi)有顯著降低,因此,確定發(fā)酵豆汁在4 ℃低溫下,保質(zhì)期至少可以達(dá)到20 d,且在保質(zhì)期內(nèi)發(fā)酵豆汁的乳酸菌活菌數(shù)在1011CFU/mL以上,其活菌數(shù)量高于市場(chǎng)上同類產(chǎn)品活菌數(shù)的100倍以上[12-15]。

表9 保質(zhì)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 9 Results of shelf life

注:同列數(shù)據(jù)之間肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

3 討論

一般發(fā)酵飲料發(fā)酵劑的接入量為3%～8%[12-13],結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)最適接種量取8%。適當(dāng)?shù)奶砑诱崽菍?duì)發(fā)酵飲料的口感給予保證,也為菌種的生長(zhǎng)提供碳源,糖濃度過(guò)低會(huì)使口感過(guò)酸,也可使生長(zhǎng)中的菌種由于缺少碳源而生長(zhǎng)不充分;而糖濃度過(guò)高會(huì)使口感過(guò)甜,滲透壓過(guò)大反而抑制菌種生長(zhǎng)[14],本實(shí)驗(yàn)中蔗糖添加量為6%時(shí)達(dá)到最高感官得分93分,因此6%為最適蔗糖添加量;培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短,使菌種生長(zhǎng)不充分,發(fā)酵飲料口感不佳。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)帶來(lái)其他雜菌的生長(zhǎng),使口感過(guò)酸或?qū)θ梭w健康不利。因此由實(shí)驗(yàn)得知6 h為最適培養(yǎng)時(shí)間;實(shí)驗(yàn)得知,培養(yǎng)溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于該菌種的生長(zhǎng),39 ℃為最適培養(yǎng)溫度。對(duì)發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和蔗糖添加量進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),得出最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間為6 h,溫度為39 ℃,蔗糖添加量為6%。并在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),感官評(píng)分達(dá)到94分,乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到3.22×1011CFU/mL。

對(duì)發(fā)酵的產(chǎn)品進(jìn)行保質(zhì)期實(shí)驗(yàn),在實(shí)驗(yàn)的20 d期間,樣品在4 ℃低溫下保藏20 d活菌數(shù)幾乎沒(méi)有下降,pH略有降低,感官品質(zhì)沒(méi)有下降,因此,確定發(fā)酵豆汁在4 ℃低溫下,保質(zhì)期至少可以達(dá)到20 d,在保質(zhì)期內(nèi)發(fā)酵豆汁的乳酸菌活菌數(shù)在1011CFU/mL以上。其活菌數(shù)量高于市場(chǎng)上同類產(chǎn)品活菌數(shù)的100倍以上[15]。本開發(fā)的發(fā)酵豆汁中除了蔗糖外,未添加任何食品添加劑,保證豆汁的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和原有的風(fēng)味,且生產(chǎn)成本低;純種發(fā)酵的豆汁營(yíng)養(yǎng)性、安全性和穩(wěn)定性都較高,口感也更容易被大眾所接受,本研究對(duì)豆汁的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)具有指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

本文以自然發(fā)酵老北京豆汁為樣品,從中篩選到一株既可以加速豆汁與淀粉分離又具有優(yōu)良豆汁發(fā)酵風(fēng)味的乳酸乳球菌乳酸亞種,將其命名為L(zhǎng)actobacilluslactissubsp.lactisLLY003。將該菌株應(yīng)用于豆汁發(fā)酵,通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn),確定了豆汁的最佳發(fā)酵工藝,在發(fā)酵時(shí)間為6 h,溫度為39 ℃,6%蔗糖添加量和8%接種量的條件發(fā)酵,豆汁的感官評(píng)分達(dá)到94分,乳酸菌活菌數(shù)可以達(dá)到3.22×1011CFU/mL。發(fā)酵豆汁在4 ℃下冷藏,在20 d保質(zhì)期實(shí)驗(yàn)期間,樣品的pH和感官評(píng)分變化不大,且發(fā)酵豆汁的乳酸菌活菌數(shù)仍在1011CFU/mL以上,發(fā)酵豆汁的保質(zhì)期至少可以達(dá)到20 d,本研究將為豆汁的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

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Isolation and identification ofLactococcuslactisand process optimization in fermented beverage of mung bean

ZHANG Li-li1,HAN Mei1,LIU Li-ying1,YU Yang1,ZHANG Zhen1,XU Yun-he2,*

(1.College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China; 2.College of Animal Husbandry & Veterinary Medicine,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China)

A strain ofLactococcuslactissubsp.lactiswith accelerating the separation of starch and good fermentation properties was isolated from Beijing Douzhi by natural fermentation. This strain was namedLactococcuslactissubsp.lactisLLY003 and applied to fermentation beverage and the supernatant of mung bean starch as substrate. Then the single factor experiment and orthogonal experiment were designed for optimizing the technology parameters. The optimal fermentation condition was inoculated amount 8% at 39 ℃ for 6 hours with 6% aucrose,under these conditions,the values of sensory reached 94 scores and the viable cells reached 3.22×1011CFU/mL. The storage shelf life could reach up to 20 days at 4 ℃ and the viable cells above one hundred billion.

beverage of mung bean;mung bean;lactic acid bacteria;fermentation

2017-01-13

張莉力(1977-)，女，博士，副教授，主要從事食品微生物研究，E-mail：13634967549@163.com。

*通訊作者:許云賀(1978-)，男，博士，副教授，主要從事畜牧微生物應(yīng)用研究，E-mail：sn_97@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301499)；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014022052)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)11-0134-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.017