元素分析儀與質(zhì)譜儀聯(lián)用鑒定蜂蜜摻假的研究

陳亞威， 張業(yè)鵬

(湖北工業(yè)大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院， 湖北 武漢 430068)

元素分析儀與質(zhì)譜儀聯(lián)用鑒定蜂蜜摻假的研究

陳亞威， 張業(yè)鵬

(湖北工業(yè)大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院， 湖北 武漢 430068)

絕大多數(shù)的天然蜂蜜均來(lái)自C3植物，其總體蜂蜜和蜂蜜蛋白均來(lái)自相同的植物碳源，二者的碳同位素組成應(yīng)該相等，即δ13CH=δ13CP。由于商業(yè)利益驅(qū)使的一些摻假行為，例如摻入C4植物糖漿，總體蜂蜜δ13CH發(fā)生改變，變化大小取決于摻假量和摻假糖漿的δ13C，但是蜂蜜蛋白δ13CP很穩(wěn)定幾乎不變。本實(shí)驗(yàn)利用穩(wěn)定同位素技術(shù)鑒定62個(gè)蜂蜜樣品，結(jié)果顯示有19.35%的蜂蜜不合格，摻假摻雜主要以添加碳-4植物源轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和淀粉糖漿為主。

元素分析-同位素質(zhì)譜； 蜂蜜； 摻假；δ13C值

蜂蜜中主要含葡萄糖、果糖和蔗糖，以及豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、多種維生素和礦物質(zhì)等，特別是其含有淀粉酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、過(guò)氧化氫酶和脂酶等多種活性酶類。由于近些年蜂蜜在國(guó)內(nèi)外需求量的增大，我國(guó)蜂蜜年銷量遠(yuǎn)大于產(chǎn)量，導(dǎo)致蜂蜜摻假摻雜行為出現(xiàn)。目前，測(cè)定蜂蜜摻假的主要方法有液相色譜示差折光檢測(cè)法、薄層色譜法(TLC法)、糖類指紋圖譜法、元素分析同位素比值質(zhì)譜法和離子色譜法等。對(duì)于現(xiàn)在市面上的摻假手段，如在蜂蜜中加入C3或C4植物糖漿，以上方法耗時(shí)長(zhǎng)，受干擾多，靈敏度不高。隨著穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，以及連續(xù)流在線裝置的集成化、多功能化和多樣化，穩(wěn)定同位素分析結(jié)果成為快速評(píng)鑒蜂蜜是否摻假的強(qiáng)有力證據(jù)。穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀與Flash 2000元素分析儀聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了快速高效、高精度和準(zhǔn)確度測(cè)定總體蜂蜜δ13CH和蜂蜜蛋白δ13CP，成為國(guó)內(nèi)外商品蜜檢測(cè)工具。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本實(shí)驗(yàn)所有蜂蜜來(lái)源于湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究所日常抽檢的62個(gè)蜂蜜樣品。

1.2 材料與試劑

鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)、超純水(Millipore公司)、硫酸(H2SO4)、錫杯(8 mm×5 mm)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(IAEA)、0.45 μm水相濾膜。

分別制備10%的鎢酸鈉溶液和0.335 mol/L硫酸溶液。

1.3 主要儀器設(shè)備

Flash 2000 HT元素分析儀，與元素分析儀聯(lián)用的Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀(EA-IRMS)，恒溫水浴鍋，低速離心機(jī)。

1.4 樣品制備

制備總體蜂蜜和蜂蜜蛋白，使用錫囊包裹。制備已知δ13C標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(如Caffeine)，使用錫囊包裹。

總體蜂蜜的制備：將蜂蜜樣品充分?jǐn)嚢?，分出試樣，裝入樣品瓶，密封，常溫下保存。蜂蜜試樣經(jīng)0.10～0.14 mm孔徑尼龍濾布過(guò)濾，除去試樣中固體雜質(zhì)后，使用百(十)萬(wàn)分之一天平稱取0.05 g，再用錫杯包裹。按上述方法重復(fù)制備3份式樣。

蜂蜜蛋白的制備：稱取10 g左右干凈的蜂蜜樣品于50 mL離心管中，然后在離心管中加入5 mL的超純水后充分混勻。在一個(gè)50 mL的燒杯里分別加入2.0 mL 10 % 的鎢酸鈉溶液和2.0 mL 0.335 mol/L的硫酸溶液，迅速混勻后，再加到上述盛蜂蜜試樣的離心管中，然后再混勻。把混勻后的蜂蜜樣品離心管放置于80℃水浴鍋中震蕩加熱不少于60 min，注意在加熱的過(guò)程中每間隔5～10 min把蜂蜜樣品離心管拿出來(lái)再振蕩20 s，直到有絮狀物析出。用超純水注滿離心管并充分混勻后放入離心機(jī)，在3500 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，后棄去上層清液，用超純水充分洗滌沉淀物，如此反復(fù)離心和洗滌沉淀物5次，最后把上清液倒完，將含有全部沉淀蛋白質(zhì)的離心管置于80℃烘箱中烘干3 h 以上。使用百(十)萬(wàn)分之一天平稱取烘干的蛋白試樣80～120 μg，再用錫杯包裹。每個(gè)蜂蜜蛋白樣品可重復(fù)制備3個(gè)。未有絮狀物析出的試樣，繼續(xù)補(bǔ)加10 % 鎢酸鈉溶液和0.335 mol /L硫酸溶液各2.0 mL，離心5 min后仍未見(jiàn)沉淀，認(rèn)為是無(wú)蛋白蜂蜜樣品。把含有蛋白的蜂蜜樣品包好入錫杯中備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

EA-IRMS質(zhì)譜條件：氧化管溫度，1 000℃；還原管溫度，825 ℃；爐溫，50℃；真空度，1.0×10-6Pa；氦氣流速，120 mL/min；GC管溫，90℃。每個(gè)樣品平行測(cè)定2次。

2 實(shí)驗(yàn)原理

采用Flash 2000 HT元素分析儀與Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀聯(lián)用設(shè)備，在線測(cè)定總體蜂蜜和蜂蜜蛋白的δ13C。將處理好的試樣裝入錫囊中，通過(guò)固體自動(dòng)進(jìn)樣器，載入具有純氧脈沖、氧化還原劑、脫鹵去硫劑存在的在線式全自動(dòng)Flash燃燒管中，試樣中的有機(jī)碳全部轉(zhuǎn)化為CO2，經(jīng)化學(xué)純化及GC分離，由ConFlo IV裝置的Open Split接口，導(dǎo)入IRMS中，測(cè)定CO2的δ13C，就相當(dāng)于原試樣中有機(jī)碳的δ13C。

Flash 2000 HT元素分析儀的氧化爐和還原爐采用一體化設(shè)計(jì)，即動(dòng)態(tài)快速燃燒爐，與氧化爐和還原爐分開(kāi)設(shè)計(jì)相比，具有更低的樣品消耗量和更高的靈敏度。在動(dòng)態(tài)快速燃燒模塊中，F(xiàn)lash燃燒管從下到上依次填充Ag2Co3O4、Cu和Cr2O3這三種化學(xué)填料，分別用作脫鹵去硫劑、還原劑和氧化劑，不同的化學(xué)填料之間通過(guò)薄層石英棉隔開(kāi)。

另外，F(xiàn)lash 2000 HT元素分析儀的另一端還配置了高溫裂解 (TC/EA)模塊。這樣，一臺(tái)元素分析儀就實(shí)現(xiàn)了多元素 (C/N/H/O)的同位素比測(cè)定，更有利于后續(xù)開(kāi)展蜂蜜試樣的多元素同位素比值分析和真實(shí)性鑒別工作。

3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

包裹好的蜂蜜樣品，按照已創(chuàng)建的測(cè)試序列，依次擺放在固體進(jìn)樣器的樣品盤上(第1個(gè)樣品放在進(jìn)樣口，后面的樣品依次擺放)，然后蓋上盤蓋，待上機(jī)測(cè)定。

在計(jì)算機(jī)上打開(kāi)Acquisition軟件窗口，在Flash HT / CO2模式下，打開(kāi)待測(cè)序列，選擇待測(cè)目標(biāo)，點(diǎn)擊Start，在彈出的Start Sequence窗口，為Results文件夾和Results文件命名，然后開(kāi)始測(cè)試。計(jì)算機(jī)會(huì)自動(dòng)給出蜂蜜樣品的δ13C值。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

62個(gè)蜂蜜樣品的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 EA-IRMS測(cè)定不同蜂蜜樣品的穩(wěn)定碳同位素比值 ‰

從表1的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)中蜂蜜樣品中總的δ13CH值和蜂蜜蛋白δ13CP的值的范圍在-24.3‰～-26.9‰之間變化，大部分蜂蜜的δ13CH值和蜂蜜蛋白δ13CP都十分接近，根據(jù)美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)正式分析方法(AOAC 998.12)和中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 18932.1-2002)，采用動(dòng)態(tài)燃燒裝置與穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)測(cè)定總體蜂蜜δ13CH和蜂蜜蛋白δ13CP，根據(jù)同位素質(zhì)量平衡方程可計(jì)算商品蜂蜜中的C4植物糖漿的碳含量

這里， -9.7代表一般地C4植物糖漿的δ13C平均值 (‰)。當(dāng)計(jì)算結(jié)果為負(fù)值時(shí)，其C4植物糖含量按0計(jì)；當(dāng)計(jì)算結(jié)果大于或等于7 % 時(shí)，應(yīng)認(rèn)為含有C4植物糖(主要指玉米糖或甘蔗糖)，即認(rèn)為摻假。

表1中9、10、11、47號(hào)等11個(gè)蜂蜜樣品中是沒(méi)有提取出來(lái)蜂蜜蛋白的，由于真實(shí)蜂蜜中含有蛋白，所以這11個(gè)蜂蜜樣品為假蜂蜜樣品。而36號(hào)蜂蜜樣品計(jì)算結(jié)果C4大于7%，所以36號(hào)蜂蜜樣品也為摻假蜂蜜樣品。其他蜂蜜樣品C4均小于7%，所以在使用本實(shí)驗(yàn)方法時(shí)，有12個(gè)蜂蜜樣品判定為摻假蜂蜜樣品，占蜂蜜樣品總數(shù)的19.35%。

圖1為測(cè)定純蜂蜜的δ13C的離子流強(qiáng)度-時(shí)間(Intensity-Time)譜圖，前面連續(xù)2個(gè)參考?xì)釩O2的平峰脈沖，蜂蜜試樣中的碳，經(jīng)過(guò)在線快速燃燒和恒溫GC分離，全部轉(zhuǎn)化為CO2，進(jìn)行同位素比質(zhì)譜分析，樣品氣CO2在譜圖上顯示為尖峰。

圖 1 EA-IRMS方法測(cè)定蜂蜜碳δ13C的離子流強(qiáng)度-時(shí)間的譜圖分析

使用電阻各不相同的萬(wàn)用三杯接收器分別接收m/z 44、m/z 45和m/z 46的離子流，在譜圖上以電

壓信號(hào)表示，所有CO2脈沖的離子流強(qiáng)度由低到高依次為m/z 44、m/z 45和m/z 46。根據(jù)參比峰和樣品峰的m/z 45與m/z 44離子流強(qiáng)度之比，得出樣品氣CO2的13C/12C。每個(gè)蜂蜜試樣重復(fù)測(cè)定3次，δ13C測(cè)定精度均好于0.15‰。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)精度較高，結(jié)果準(zhǔn)確。

[1] GB/T 18932.1-2002. 蜂蜜中碳-4 植物糖含量測(cè)定方法-穩(wěn)定碳同位素比率法[S].

[2] GB/T 18932.22-2003.蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的測(cè)定方法-液相色譜示差折光檢測(cè)法[S].

[3] 費(fèi)曉慶,吳斌,沈崇鈺,等.液相色譜/元素分析-同位素比值質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定蜂蜜摻假[J].色譜,2011,29(1):15-19.

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[責(zé)任編校： 張 眾]

Element Analyzer with a Stable Isotope Ratio Massspectrometry Combined with Identification of Adulteration in Honey

CHEN Yawei, ZHANG Yepeng

(SchoolofMechanicalEngin.,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China)

Honey is a kind of high-quality natural sweetening agent. The vast majority of natural honey comes from C3 plants. The overall honey and honey protein are from the same plant carbon source, whose carbon isotope composition should be equal; that is, Delta13CH= Delta13CP. Due to some adulteration of commercial interest, for example, the incorporation of plant C4 syrup, honey, overall13CHis changed depending on the size and amount of syrup adulteration adulteration of delta13C; however, Delta13CPprotein is stable but honey is almost the same. In this study, 62 honey were identified by stable isotope technique.The results showed that 19.35% samples of honey adulteration is not qualified, mainly because carbon doped -4 plant transformation products and starch syrupwere were added. Therefore,the monitoring and management of this kind of adulteration should be strengthened.

elemental analysis isotope mass spectrometry；honey；adulteration；δ13C

2017-03-08

陳亞威(1991-)， 男，湖北武漢人，湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量控制與檢測(cè)

1003-4684(2017)02-0021-03

S896.1, TS207.3

A