人乳頭瘤病毒感染與喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及預(yù)后的關(guān)系

劉丹凌 徐雅男 王家東

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·臨床研究·

人乳頭瘤病毒感染與喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及預(yù)后的關(guān)系

劉丹凌 徐雅男 王家東

目的 探討人乳頭瘤病毒(HPV)與喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)發(fā)生的關(guān)系以及HPV對LSCC患者預(yù)后的影響。方法 回顧分析2004～2013年在本科就診的252例LSCC患者的臨床資料。所有手術(shù)標(biāo)本為4 μm厚切片，通過P16免疫組織化學(xué)染色及熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測HPV的陽性率及分型。p16及HPV DNA同時陽性時認(rèn)為HPV感染陽性。采用Kaplan-Meier法統(tǒng)計252例LSCC患者的總生存率及HPV陽性率對患者生存率的影響。結(jié)果 252例LSCC患者的P16陽性率為7.1%(18/252)， HPV DNA的陽性率為6.0%(15/252)，其中14例為HPV-16感染(93.3%)，1例為HPV-18感染(6.7%)。252例LSCC患者的3年總生存率為67.0%，HPV DNA陽性患者的3年生存率為77.0%，HPV陰性患者的3年生存率為65.0% (P=0.25)。結(jié)論 中國LSCC人群中HPV的陽性率較低。HPV感染與LSCC患者的預(yù)后無顯著關(guān)系。(中國眼耳鼻喉科雜志，2017，17：170-175)

腫瘤，鱗狀細(xì)胞，喉；P16蛋白；乳頭瘤病毒,人；生存率

頭頸部腫瘤是全球第6大常見腫瘤，其中喉癌高居發(fā)病第2位，且95%為鱗狀細(xì)胞癌[1-2]。以往研究[3]認(rèn)為吸煙與飲酒是導(dǎo)致喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma , LSCC)的主要因素，但近年來國外文獻(xiàn)[2,4]報道合并人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染且無吸煙及飲酒史LSCC患病數(shù)量呈上升趨勢。在HPV感染介導(dǎo)的LSCC發(fā)生過程中，HPV的DNA整合入宿主細(xì)胞基因后，通過E6、E7癌基因編碼的癌蛋白干擾P53及視網(wǎng)膜母細(xì)胞蛋白(protein-retinoblastoma, pRb)通路的正常功能，表現(xiàn)為P53野生型及P16蛋白表達(dá)特異性上調(diào)；而其他原因如吸煙、飲酒引起的LSCC則表現(xiàn)為P53突變型及P16蛋白表達(dá)特異性下調(diào)[3,5]。因此可以通過P16蛋白初步篩查LSCC患者HPV的感染率[5-7]，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測HPV DNA的方法，明確受試者的HPV感染狀態(tài)[8]。HPV的感染狀態(tài)對于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)患者的預(yù)后影響差異很大。多項研究報道了HPV陽性的口咽部鱗狀細(xì)胞癌(oropharyngeal, OPSCC)患者預(yù)后較陰性患者更好[9-12]，而HPV感染對非口咽鱗狀細(xì)胞癌患者(non- oropharyngeal, NPSCC)預(yù)后的影響目前尚無明確定論[13-14]。本研究旨在通過檢測P16蛋白的表達(dá)結(jié)合HPV DNA熒光定量PCR檢測，分析LSCC患者中HPV的感染率，探究HPV與LSCC發(fā)生的關(guān)系。Kaplan-Meier法統(tǒng)計患者生存率，評估HPV感染與LSCC患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究納入2004年1月～2013年12月就診于本科并接受手術(shù)治療的252例LSCC患者?；颊呔弦韵氯虢M標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未經(jīng)放療或化療，大體標(biāo)本滿足P16蛋白的免疫組織化學(xué)染色及行PCR法檢測HPV DNA的要求，并能長期在本科隨訪；由于目前生殖道HPV感染和LSCC中HPV感染的關(guān)系尚不明確，在考慮減少實驗的干擾因素以及參考他人OPSCC實驗基礎(chǔ)上[15]，排除合并婦科HPV感染的患者。

252例LSCC患者中，男性244例、女性8例；年齡41～89歲，平均62.5歲。252例LSCC患者的所有臨床數(shù)據(jù)均可在本院的電子病歷系統(tǒng)中查證。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)的分類系統(tǒng)對腫瘤進(jìn)行TNM分期。具體TNM分期情況見表1。本研究剔除了術(shù)前已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。本實驗通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并取得受試患者的知情同意。

電子病歷系統(tǒng)中記錄患者的煙酒史。吸煙者定義為個人每周至少吸香煙、煙斗、雪茄或其他煙草制品，并持續(xù)1年以上[16]。飲酒者定義為個人每月至少飲用170 g白酒、340 g啤酒或42.5 g烈酒，并持續(xù)1年以上[4]。

表1 252例LSCC患者的臨床TNM分期(n)

每位患者一塊10%甲醛(福爾馬林)固定石蠟包埋的腫瘤蠟塊，組織切片并行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining, HE)。2位病理科醫(yī)師分別對HE切片進(jìn)行讀片，并診斷這些蠟塊為LSCC。

1.2 治療方法 患者接受常規(guī)的手術(shù)治療，且在術(shù)前未接受放療或化療。原發(fā)灶為T3期或者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為N2期的患者術(shù)后接受放療，原發(fā)灶為T4期或切緣陽性患者術(shù)后接受放療的同時行順鉑和多烯紫杉醇(商品名：泰素帝)聯(lián)合化療。T1、T2、N0、N1期患者術(shù)后長期隨訪且無進(jìn)一步治療(圖1)?；颊叩闹委煼绞脚cHPV感染狀態(tài)無關(guān)，因為HPV感染檢查不是我科對這類患者的術(shù)前常規(guī)檢查項目。

圖1. 喉癌患者接受的治療

1.3 P16免疫組織化學(xué)法檢測HPV感染 將患者手術(shù)時所取的組織蠟塊切4 μm的薄片。P16免疫組織化學(xué)檢測使用專用的試劑盒(CINtec P16 Histology，mtm laboratories，Roch)在Benchmark XT(Roche)上按照說明書操作。使用標(biāo)準(zhǔn)化P16陽性的OPSCC切片作為陽性對照，不加一抗的染色切片作為陰性對照。P16免疫組織化學(xué)陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)采用羅氏公司該試劑應(yīng)用的通用標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中超過70%的細(xì)胞存在彌漫性深褐色染色為陽性，其他染色都判斷為陰性[2, 15]。另有2名資深頭頸部腫瘤病理學(xué)專家分別對該免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.4 DNA抽提及熒光定量PCR檢測 上述石蠟包埋的腫瘤蠟塊每塊切取2 μm的薄片10片，切片時注意避免不同蠟塊間的交叉污染。使用Qiagen FFPE試劑盒(Hilden, 德國)，根據(jù)試劑盒說明書按步驟提取DNA。提取后使用NanoDrop測定DNA的純度和濃度，并將合格的DNA樣本保存在-20 ℃。使用HPV 16/18 亞型核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒(Qiagen，德國)進(jìn)行定量PCR檢測：按試劑盒操作說明，在PCR反應(yīng)液40 μL中，分別加入HPV 16 與HPV 18的引物[17]和2.5 μL的Taq酶。充分混勻后加入RT-PCR專用八連管中，每份加入處理后的組織DNA 2 μL 或試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品，放入全自動熒光定量PCR儀中，按照使用說明進(jìn)入循環(huán)程序；95 ℃酶活化15 min，95 ℃變性1 min，初始50 ℃進(jìn)行線性降溫，每個循環(huán)下降0.5～40 ℃，最后72 ℃延伸1 min。陰性對照及陽性對照由試劑盒提供。利用IQ5分析軟件，計算每份DNA的拷貝數(shù)。

1.5 隨訪 252例患者治療完成后前3年內(nèi)每3個月隨訪1次，第4年起每6個月隨訪1次，第6年起每12個月隨訪1次。隨訪內(nèi)容包括：纖維喉鏡或電子喉鏡檢查及影像學(xué)檢查[CT、磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)、正電子發(fā)射型計算機(jī)斷層顯像(positron emission computed tomography,PET)、胸部X線片、肝臟超聲等]評估治療情況。隨訪過程中，當(dāng)頸部或肝臟超聲懷疑有腫瘤轉(zhuǎn)移可能或喉鏡檢查發(fā)現(xiàn)新生物時，再行CT、MRI及PET檢查。術(shù)后復(fù)發(fā)及并發(fā)癥沒有包含在本研究的統(tǒng)計范疇內(nèi)，本研究僅統(tǒng)計總體生存情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計描述。分類變量采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，雙側(cè)檢驗P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Kaplan-Meier法統(tǒng)計生存率，存活患者計算從治療結(jié)束到最后1次隨訪的生存時間，已死亡患者計算從治療結(jié)束到死亡的時間。

2 結(jié)果

2.1 P16及HPV DNA的陽性率 252例LSCC患者中，P16陽性率為7.1%(18/252),HPV DNA的陽性率為6.0% (15/252)。15例HPV DNA陽性患者中，14例(93.3%)為HPV 16陽性，1例(6.7%)為HPV 18陽性。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，患者的吸煙、飲酒情況，腫瘤部位以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與P16的表達(dá)無顯著相關(guān)(P>0.05)，與HPV DNA的表達(dá)無顯著相關(guān)(P>0.05)(表2)。LSCC患者P16染色情況見圖2。

表2 252例LSCC患者的臨床特征[n(%)]

圖2. LSCC患者的p16染色情況 A.LSCC p16陽性：惡性腫瘤的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中超過70%的細(xì)胞存在彌漫性深褐色染色；B.LSCC p16陰性：低于70%的惡性腫瘤細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)存在彌漫性深褐色染色(×100)

2.2 P16、HPV DNA表達(dá)與LSCC患者的預(yù)后 252例LSCC患者的平均隨訪時間為42.7個月(3～113個月)。198例患者存活，平均隨訪47.3個月(6～113個月)；54例患者死亡，平均隨訪25.9個月(3～80個月)。3年總生存率為67.0%(圖3、表3)。

圖3. LSCC患者3年的總生存率

表3 LSCC患者3年生存情況

18例P16陽性患者術(shù)后3年的總生存率為80%，平均生存時間為54.7個月。234例P16陰性患者術(shù)后3年的總生存率為65%，平均生存時間為41.8個月。2組的生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.11)(圖4、表4)。

圖4. P16陽性和陰性2組患者生存曲線

表4 P16陽性和陰性LSCC患者生存情況

15例HPV DNA陽性患者術(shù)后3年的總生存率為77%，平均生存時間為56.3個月。237例HPV DNA陰性患者術(shù)后3年的總生存率為65%，平均生存時間為41.9個月。2組的生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.25)(圖5、表5)。

圖5. HPV DNA陽性和陰性 2組患者生存曲線

表5 HPV DNA陽性和陰性患者生存情況

3 討論

P16蛋白表達(dá)升高是HPV感染后一個特征性的指標(biāo)[18]，這種現(xiàn)象是由于HPV的E7癌蛋白與pRb結(jié)合，導(dǎo)致pRb/E2F復(fù)合體解離，P16與“cyclin Dl-CDK4/CDK6”形成的復(fù)合體無法通過作用于pRb/E2F復(fù)合體抑制細(xì)胞增殖而出現(xiàn)過表達(dá)。在參考宮頸癌P16臨床篩查[19-20]的基礎(chǔ)上，本實驗將標(biāo)準(zhǔn)化的P16免疫組織化學(xué)染色作為臨床大樣本檢測LSCC患者HPV感染的初篩實驗，取得較好的結(jié)果：敏感度為100%，特異度為83.3%。這和Xu等[7]和Venuti等[8]報道P16免疫組織化學(xué)法檢測HNSCC中HPV感染敏感度可達(dá)100%，特異度為65%～79%的情況相符合。說明標(biāo)準(zhǔn)化的P16免疫組織化學(xué)作為HNSCC患者HPV的初篩實驗具有較好的臨床可行性。同時在P16免疫組織化學(xué)的基礎(chǔ)上聯(lián)合PCR熒光定量法HPV DNA分型檢測，說明HPV感染后進(jìn)入宿主細(xì)胞并產(chǎn)生活性蛋白質(zhì)產(chǎn)物，從而進(jìn)一步明確患者的HPV感染情況。相較于HPV檢測的金標(biāo)準(zhǔn)：即在新鮮或冷凍組織中發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7的mRNA[8, 21]，具有經(jīng)濟(jì)便利的特點，并且能更好地用于回顧性研究[6-8]。本實驗中HPV DNA主要檢測HPV 16和HPV 18，這2種類型都屬于高危型HPV(指HPV持續(xù)感染與宮頸癌及外生殖器癌變關(guān)系密切的HPV類型)，特別是HPV 16，在HPV相關(guān)的OPSCC中感染率可達(dá)95%[2]，所以本實驗主要進(jìn)行這2型HPV的檢測。這也是本實驗的局限之處，所以下一步我們將在擴(kuò)大樣本量的同時，檢測其他類型HPV的感染情況。

LSCC患者中HPV感染率差異很大(<3.8%～28%)[22-24]。本實驗中252例LSCC患者P16的陽性率為7.2%，HPV的感染率僅為6.0%。較低感染率可能由以下因素導(dǎo)致。首先，HPV感染存在種族差異。Schabath等[25]對不同種族男性HPV(特別是高危型HPV感染)感染率的研究發(fā)現(xiàn)，亞洲人種或太平洋島嶼人種的感染率為18.7%，混血人種為20.8%，白種人為25.1%，黑種人為25.4%。因為本實驗中的納入對象均為中國籍亞洲人種，LSCC患者中HPV感染率較低和這種現(xiàn)象相符。其次，HPV的感染率存在地域差異。相對于美國2項研究[23,26]報道LSCC人群中HPV較高的感染率(23.7%和24.0%)，本實驗中HPV的感染率較低，和法國與德國進(jìn)行的幾項研究[22,24]報道的HPV感染率較接近(<3.8%和5.0%)。再次，HPV感染情況在不同部位的HNSCC中差異很大，HPV感染與扁桃體癌關(guān)系最強(qiáng)(OR：15.1，95% CI:6.8～33.7)，其次是OPSCC (OR:4.3，95% CI:2.1～8.9)，最弱的是口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral cavity squamous cell carcinoma, OCSCC) (OR:2.0，95% CI:1.2～3.4)及LSCC(OR:2.0，95% CI:1.0～4.2)[27]。本實驗結(jié)果和上述情況較為符合，說明HPV感染具有一定的組織傾向性，這需要進(jìn)一步的實驗探究。但綜合以上內(nèi)容可以認(rèn)為中國LSCC人群中HPV的感染率較低。

由于HPV感染陽性的HNSCC發(fā)生機(jī)制主要依賴于癌基因E6和E7作用的pRb這一單一通路；而HPV感染陰性的HNSCC存在更多的基因突變，意味著更多信號通路的改變使其預(yù)后相對更差[3]。因此Leemans等[3]在分子水平認(rèn)為HPV感染陽性的HNSCC患者預(yù)后較好。然而，在臨床隨訪中不同HNSCC合并HPV感染的預(yù)后差異很大。HPV感染陽性的OPSCC患者較HPV感染陰性的患者預(yù)后更好。Fakhry等[28]在96例OPSCC患者的前瞻性研究中報道了HPV陽性患者2年總體生存率和無瘤生存率均優(yōu)于HPV陰性患者。Rischin等[10]在一項對185例OPSCC患者的回顧性研究中同樣發(fā)現(xiàn)HPV陽性患者生存更佳。而在NPSCC患者，HPV感染狀態(tài)和預(yù)后并無顯著相關(guān)。Chung等[29]回顧研究報道了在NPSCC中HPV陽性和HPV陰性患者的生存情況無顯著差別。Xu等[7]在674例NPSCC中同樣報道了HPV感染狀態(tài)與患者預(yù)后無關(guān)，盡管HPV陽性NPSCC患者的生存時間較HPV陰性NPSCC患者的生存時間更長。本實驗中P16陽性與陰性患者的3年總生存率分別為80%和65%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);HPV陽性和陰性患者的3年總生存率為77%和65%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且P16及HPV陽性患者的平均生存時間較HPV陰性患者長。這與國內(nèi)外多數(shù)文獻(xiàn)[1-3, 9]報道結(jié)果相符。HPV感染狀態(tài)在LSCC患者生存情況并無明顯差異，這可能是由于HPV感染在不同的HNSCC中轉(zhuǎn)化過程不同造成的。

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(本文編輯 楊美琴)

Correlation between human papillomavirus infection and the pathogenesis and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma

LIUDan-ling，XUYa-nan，WANGJia-dong.
DepartmentofHeadandNeckSurgery，RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200001，China

WANG Jia-dong,Email：drjiadongw@aliyun.com

Objective To determine whether human papillomavirus (HPV) infection is related to the prevalence and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC). Methods A retrospective cohort study was applied on a total of 252 LSCC patients enrolled from 2004 to 2013. Paraffin-embedded tissues were cut as 4 μm slices. P16 immunohistochemistry and fluorescence quantitation polymerase chain reaction (PCR) high risk HPV DNA tests were applied to detect the HPV infection status respectively in 252 specimens. Long-term survival rates were calculated using the Kaplan-Meier method. Results The p16 positive rate of all the patients was 7.1% (18/252). Six percent (15/252) of LSCC patients were HPV DNA positive. All the HPV DNA positive patients were p16 positive, 93.3%(14/15) of the HPV DNA positive patients were HPV type 16 and the rest was HPV type 18. The 3-year overall survival rates were 67.0% for all 252 patients, 77.0% for HPV DNA positive patients, 65.0% for HPV DNA negative patients (P=0.25). Conclusions HPV has low prevalence in Chinese LSCC people. HPV infection status is associated with LSCC but may not be an available prognostic factor for LSCC. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:170-175)

Tumor, squamous cell, laryx; P16 protein; Papillomavirus, human; Survival rate

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院頭頸外科 上海 200001

王家東(Email:drjiadongw@aliyun.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.03.006

2016-10-09)