油菜BnERF1基因的克隆及其過表達載體的構(gòu)建

潘宣丞++杜雪竹

摘要：利用擬南芥ERF1基因的序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索油菜（Brassica napus）ERF1基因的序列信息，并設(shè)計特異性引物，PCR擴增油菜BnERF1基因。結(jié)果表明，成功擴增出油菜BnERF1基因，并構(gòu)建了過表達載體pCAMBIA2301-ERF1，為進一步研究BnERF1的抗病分子機理和選育新的抗病油菜種質(zhì)奠定了試驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：油菜（Brassica napus）；ERF1；克??；載體

中圖分類號：Q78 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）10-1968-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.042

Cloning of BnERF1 Gene from Rape and Construction of Its Overexpression Vector

PAN Xuan-cheng，DU Xue-zhu

（College of Life Sciences， Hubei University，Wuhan 430062，China）

Abstract：By the sequence of Arabidopsis thaliana ERF1， the sequence information of Brassica napus ERF1（BnERF1） was retrieved in NCBI database. According to the sequence that we found， the unique primer for amplification BnERF1 was designed. Results were confirmed that the gene of BnERF1 and the overexpression vector pCAMBIA2301-ERF1 were successfully obtained. It laid foundation for further research on disease resistance molecular mechanism of BnERF1 and breeding new disease-resistant rape germplasm.

Key words：Brassica napus；ERF1；cloning；vector

油菜（Brassica napus）隸屬十字花科蕓薹屬，是中國一種非常重要的油料經(jīng)濟作物，其種子含油量高達33%～55%。油菜用途廣泛，除了能榨取食用油和作物飼料外，還在醫(yī)藥、食品和工業(yè)原料等方面均有廣泛應(yīng)用[1]。目前中國的油菜種植面積約為666.7萬hm2，占世界油菜總種植面積的1/3[2]。油菜與其他農(nóng)作物一樣，其生長過程受到多種病蟲害的危害，導(dǎo)致產(chǎn)量受損。ERF因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族[3]，其家族成員能夠與GCC-box結(jié)合[4]，當(dāng)植物受到致病菌侵害時產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)ERF家族的B3亞族中大部分轉(zhuǎn)錄因子都能在植物受到致病菌侵染時起作用，如ERF1、ERF2和ORA59等[5-8]。在擬南芥中，ORA59能夠通過結(jié)合PDF1.2（PLANT DEFENSIN1.2）啟動子區(qū)的GCC-Box來調(diào)控PDF1.2的表達，同時可以增強對枯萎病和灰霉病等病害的抗性[9]。在煙草中過表達ERF1，接種TMV后，發(fā)現(xiàn)ERF1受到到TMV誘導(dǎo)，表達水平上調(diào)抗病性是否增強[10]。同時，ERF1被發(fā)現(xiàn)位于JA-ET抗病信號途徑的交叉位置[7]。研究表明，ERF1是參與植物的生物脅迫誘導(dǎo)的功能基因，本研究通過同源克隆法獲得了油菜的BnERF1基因，構(gòu)建了BnERF1過表達載體，為今后通過遺傳轉(zhuǎn)化選育出新的油菜抗病品種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘藍型油菜Westar由湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α菌株和克隆載體B-Zero購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，改造過的表達載體pCAMBIA 2301由湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室保存。

1.1.3 試劑 限制性內(nèi)切酶和PrimerStar Mix購于寶生物工程（大連）有限公司；15 K DNA Marker、DL2000 DNA Marker和100bp DNA Ladder購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；1 kb plus DNA Ladder、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油菜總DNA的提取 取油菜Westar葉片約0.5 g，液氮研磨成粉狀，利用2×CTAB法抽提油菜Westar的總DNA，并于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 油菜ERF1基因的cDNA片段的擴增、克隆和測序 用擬南芥ERF1基因序列作為探針，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，找到序列同源性較高的油菜序列，設(shè)計引物，上游引物為5′-GGGGTACCAGCCACTAACGATCCTAACTGAAAAC-3′；下游引物為：5′-AACTGCAGAGAAACATCGAAA AGCTTAAGGACC-3′。以油菜Westar的總DNA為模板（該基因的DNA沒有內(nèi)含子，所以直接用DNA作為模板），利用引物BnERF1-F和BnERF1-R進行PCR。將PCR產(chǎn)物電泳，切膠回收，連接到B-Zero載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將鑒定后菌液送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 過表達載體的構(gòu)建

1）酶切。將測序結(jié)果良好的樣品，抽提質(zhì)粒，用KpnⅠ和PstⅠ對重組質(zhì)粒進行酶切。在干浴鍋中37 ℃酶切3 h。酶切完成加入10×Loading Buffer終止酶切，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收。

2）目的片段與表達載體的連接轉(zhuǎn)化。將回收的片段與改造過的pCAMBIA 2301載體進行連接，16 ℃連接過夜。將全部的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜總DNA的提取結(jié)果

利用2×CTAB法抽提油菜Westar葉片的總DNA后，以121 V電壓，1%的瓊脂糖非變性凝膠進行電泳檢測（圖1）。從圖1中可以看到，目的條帶為一條清晰的條帶，同時，OD260 mm/OD280 mm在1.8～2.0，表明無苯酚和蛋白質(zhì)污染，DNA的純度較高。

2.2 BnERF1基因的克隆

以BnERF1-F和BnERF1-R為引物，油菜Westar葉片的DNA為模板，利用PrimerStar Mix高保真酶進行PCR克隆了ERF1基因的cDNA片段，PCR擴增產(chǎn)物如圖2所示。測序結(jié)果表明，ERF1的片段大小為778 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 ERF1基因片段的生物信息學(xué)分析

該基因含有778個核苷酸，利用NCBI中的ORF軟件分析，表明該片段含1個633 bp的開放閱讀框（圖3），編碼1個含有210個氨基酸的多肽。通過BLAST編碼蛋白的預(yù)測，并與山崳菜屬、薺菜、擬南芥、擬南芥琴亞種、高山芥、苜蓿等植物中的該蛋白進行同源性比對。結(jié)果（圖4）表明，蛋白序列的同源性較高，分別為88%、88%、87%、85%、83%、86%。進化分析進一步顯示出各種植物的ERF1蛋白的進化關(guān)系（圖5），擬南芥與油菜的親緣關(guān)系最為接近，屬于同一個種。山崳菜、芥菜和油菜的親緣關(guān)系次之，同屬一個目。苜蓿與其他相比，和油菜的親緣關(guān)系最遠。

2.4 油菜ERF1基因過表達載體的構(gòu)建

以含有油菜ERF1基因的B-Zero重組質(zhì)粒為模板，KpnⅠ和PstⅠ酶切出778 bp的片段（圖6）。切膠回收后，將其連接pCAMBIA 2301載體上，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-ERF1。

3 小結(jié)與討論

ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其能對植物遭受的生物脅迫和非生物脅迫做出應(yīng)答反應(yīng)，從而提升植物對逆境脅迫的耐受力。根據(jù)擬南芥中ERF1的序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源比對，然后根據(jù)挑取同源性高的油菜預(yù)測序列，設(shè)計了特異性引物，直接從油菜DNA中擴增出BnERF1基因，得到油菜ERF1基因。通過對其序列的分析，BnERF1基因全長778 bp，屬于ERF家族的B3亞族。通過生物信息學(xué)分析，該片段含有ERF家族的功能區(qū)，構(gòu)建BnERF1的過表達載體，為研究該基因的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。

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