魚腥草根總黃酮的超聲波輔助提取與體外抗氧化性研究

李湘++呂芳楠++朱洪平++螯琴++孫建波

摘要：通過單因素和正交試驗對魚腥草（Houttuynia Cordata）根總黃酮的超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用ABTS·+、·OH和H2O2清除試驗，結(jié)合亞油酸乳化體系和豬油，研究了魚腥草根總黃酮的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，魚腥草根總黃酮提取工藝為在超聲功率200 W下，按固液比1∶60（g/mL），加入60%乙醇，55 ℃下提取35 min，總黃酮提取率達(dá)2.00%；魚腥草根總黃酮的ABTS·+清除率隨著濃度的升高而逐漸趨于穩(wěn)定，·OH、H2O2清除率與濃度具有線性正相關(guān)性，均高于同濃度的VC溶液；魚腥草根總黃酮可有效抑制亞油酸的過氧化反應(yīng)，提高豬油的貯藏穩(wěn)定性。綜上所述，魚腥草根總黃酮具有很好的體外抗氧化活性和脂質(zhì)過氧化抑制效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：魚腥草（Houttuynia Cordata）根；總黃酮；提取；抗氧化；脂質(zhì)過氧化

中圖分類號：TQ461 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）10-1928-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.032

Ultrasonic Assisted Extraction of Flavonoids from Houttuynia Cordata Roots

and Its Antioxidation in Vitro

LI Xiang， LV Fang-nan， ZHU Hong-ping， AO Qing， SUN Jian-bo

（College of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： The single factor and orthogonal design experiments were used to optimize the ultrasonic assisted extraction of flavonoids from Houttuynia Cordata roots and its antioxidant acitivities were evaluated in vitro by scavenging capabilities of ABTS·+，·OH and hydrogen peroxide and the lipid peroxidation inhibition in both linoleic acid-in-water emulsion and lard models.Results showed the highest extraction yield of flavonoids from Houttuynia Cordata roots could obtain to be 2.00%，using ethanol concentration of 60%（v/v） as feed-to-liquid ratio of 1∶60（g/mL） extracted for 35 min at 55 ℃ assisted with ultrasound of 200 W. The ABTS·+ scavenging rate of flavonoids was improved to a stable value with the increasing concentration. The ·OH and hydrogen peroxide scavenging rates of flavonoids were significantly positive correlation with concentration，and both higher than Vc solution with the same concentration. Lipid peroxidation in linoleic acid was effectively inhibited by flavonoids，as well as the storage stability of lard was improved. It was indicated that the flavonoids from Houttuynia Cordata roots possessed good vitro antioxidation and lipid peroxidation inhibition.

Key words： Houttuynia Cordata roots； flavonoids； extraction； antioxidation； lipid peroxidation

研究表明，長期的氧化應(yīng)激狀態(tài)可導(dǎo)致生物體細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)、糖類、脂類等大分子物質(zhì)的積累性氧化損傷，從而加速細(xì)胞衰老，造成機(jī)體損傷與破壞，誘發(fā)炎癥、心血管疾病、癌癥和神經(jīng)性疾病等慢性病[1]，而攝入外源抗氧化劑可有效緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御體系的能力，預(yù)防或緩解相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展[2]。隨著人們食品安全意識的增強(qiáng)，追求健康、崇尚天然食品已成為現(xiàn)代生活的一種潮流，從自然界尋找天然、高效、多能的食源性抗氧化劑已引起各國科學(xué)家的重視，具有廣闊的發(fā)展前景和深遠(yuǎn)意義。

魚腥草（Houttuynia cordata Thunb）又名蕺菜、側(cè)耳根，屬三白草科蕺菜屬多年生草本植物，因全草帶魚腥味而得名，是國家衛(wèi)生部確認(rèn)的“藥食兼用型”植物，具有豐富的營養(yǎng)價值[3]和良好的保健功能[4-6]。近年來，隨著人們回歸自然、喜食山野菜之風(fēng)的盛行，涼拌魚腥草根因其口感爽脆、食之齒頰生香，已由民間傳統(tǒng)美食堂而皇之地登上了餐館和酒樓的餐桌，并在涼拌的基礎(chǔ)上開發(fā)出系列風(fēng)味菜肴，深受顧客歡迎。魚腥草的人工種植規(guī)模隨之?dāng)U大，地下莖產(chǎn)量也成為栽培的主要目標(biāo)[7，8]。研究表明，魚腥草的品種[9，10]、產(chǎn)地[11，12]、種植方式[8]均能影響總黃酮的含量與組成，并且葉的總黃酮含量高于根[13]，但根的魚腥味較輕、口感獨(dú)特，食用時更受消費(fèi)者歡迎。然而，現(xiàn)有文獻(xiàn)大多集中于魚腥草總黃酮和葉總黃酮的提取、鑒定與活性研究[14-17]。因此，本研究將對魚腥草根總黃酮的超聲輔助提取工藝與體外抗氧化活性進(jìn)行研究，為將魚腥草根開發(fā)為功能性食品與食源性天然抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚腥草根購于湖北省恩施市土橋壩三孔橋農(nóng)貿(mào)市場；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ABTS粉末（生物試劑）購于上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；豬油是由市購豬板油在實驗室經(jīng)高溫提煉制得；亞油酸（生物試劑）購于安慶中創(chuàng)生物工程有限公司；其他試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗設(shè)備

UV765紫外可見分光光度計，瑞士Tecan infinite M200PRO光柵型多功能酶標(biāo)儀，Mettler AL104型電子分析天平，KQ5200型超聲波清洗器，GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，800B離心機(jī)。

1.3 試驗方法

1.3.1 總黃酮提取 ①提取方法。魚腥草根去除根須、洗凈、切碎、70 ℃烘干、粉碎。稱取2.0 g魚腥草粉，置于圓底燒瓶中，按不同固液比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，200 W超聲提取一定時間后過濾，離心取上清液，即得樣品提取液。②工藝優(yōu)化。選取固液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度作為影響魚腥草根總黃酮提取率的研究對象，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（34）正交試驗（表1），并對最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行驗證。③總黃酮提取率的測定。采用Al（NO3）3-NaNO2比色法測定樣品提取液中的總黃酮含量。吸取樣品提取液20 mL于50 mL容量瓶中，加入30%乙醇5.0 mL、5% NaNO2溶液2.0 mL，搖勻；放置6 min后加10% Al（NO3）3溶液2.0 mL，搖勻；放置6 min后加1 mol/L的NaOH溶液20 mL，最后加水至刻度處，搖勻；放置15 min后于500 nm下測定其吸光度（以提取液作參比）。根據(jù)槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（y=18.571x+13.333，R2=0.992 2），求得每毫升樣品溶液的總黃酮含量，然后計算總黃酮提取率：

1.3.2 體外抗氧化活性測定 以最優(yōu)工藝制備的樣品提取液為原液，經(jīng)1、2、3、4、5倍稀釋后，進(jìn)行體外抗氧化活性評價。

1）ABTS·+清除活性。吸取7 mmol/L ABTS溶液5 mL，加入140 mmol/L K2S2O8溶液88 μL，混合后于室溫下避光過夜，制得ABTS·+儲備液（OD734=0.70±0.02）。移取不同濃度的魚腥草總黃酮溶液50 μL于96孔板中，再加入ABTS·+溶液150 μL，混勻，放置10 min后，在734 nm處測吸光度（At）；以無水乙醇50 μL+ABTS·+150 μL為空白試劑，在734 nm處測得吸光度（A0）；以總黃酮50 μL+無水乙醇150 μL為對照試劑，以排除總黃酮和乙醇本身吸光度的影響，在734 nm處測得吸光度（Ac）。以VC作陽性對照，計算樣品溶液的ABTS·+清除率：

2）·OH清除活性。移取10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL、1.5 mmol/L FeSO4溶液溶液1 mL、6 mmol/L的H2O2溶液1 mL于試管中，加入不同體積的魚腥草總黃酮稀釋液，用乙醇補(bǔ)足至4 mL，于510 nm處測定吸光度（Ax）；另取兩組試管中，其中一組不加魚腥草總黃酮稀釋液，于510 nm處測定吸光度（A0），另一組不加H2O2溶液，于510 nm處測定吸光度（Axo）；歸零管中試劑為水楊酸-乙醇1 mL、FeSO4溶液1 mL、80%乙醇溶液2 mL，于510 nm處測定吸光度（A′）。以VC作陽性對照，計算樣品溶液的·OH清除率：

3）H2O2清除活性。選取5支25 mL試管，向其中分別加入不同濃度的魚腥草總黃酮溶液3.4 mL、40 mmol/L H2O2溶液0.6 mL，于230 nm處測得吸光度（AX′）；另取兩組試管，其中一組以0.1 mmol/L pH7.4磷酸緩沖液代替H2O2溶液，于230 nm處測得吸光度（AC′），另一組以蒸餾水代替總黃酮溶液，于230 nm處測得吸光度（AO′）；調(diào)零管中加入3.4 mL蒸餾水和0.6 mL磷酸緩沖液。以VC作陽性對照，計算樣品溶液的H2O2清除率：

1.3.3 脂質(zhì)過氧化分析 1）亞油酸過氧化模型。采用硫氰酸鐵法測定亞油酸乳化體系的過氧化程度。取不同濃度的魚腥草總黃酮4.0 mL，加入2.5%亞油酸（95%乙醇配制）4.1 mL、磷酸緩沖溶液（pH 6.86）8.0 mL、蒸餾水3.9 mL，放入40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別于30 min、24 h、48 h后平行取樣；向10 mL試管中加入0.1 mL油樣、9.7 mL 95%乙醇、0.1 mL 30%硫氰酸銨溶液、0.1 mL的0.02 mol/L FeSO4溶液（0.02 mol/L鹽酸配制），室溫下精確反應(yīng)3 min后，于500 nm下測吸光度（At）；對照組中不加入魚腥草總黃酮溶液，以95%乙醇代替，測得吸光度（A），計算脂質(zhì)過氧化抑制率：

抑制率=■×100% （5）

2）豬油氧化模型。采用Schaal烘箱法進(jìn)行加速氧化試驗。將魚腥草總黃酮原提液按油樣質(zhì)量的0.02%、0.05%、0.20%、0.50%、1.00%加入到豬油中，混合均勻，敞口放置于65 ℃烘箱中，每12 h攪拌一次，每天定時取樣一次；根據(jù)GB/T 5009.37-2003，采用硫代硫酸鈉滴定法測定油樣的過氧化值（POV），同時以未加魚腥草總黃酮溶液的新鮮油樣為空白對照，分析魚腥草總黃酮提取液對豬油加速氧化過程的抑制情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腥草總黃酮的超聲輔助提取

總黃酮是魚腥草中除揮發(fā)油之外的主要功效成分，總黃酮提取率的高低與活性強(qiáng)弱直接決定著魚腥草的品質(zhì)及其高效開發(fā)與利用。植物總黃酮的常用提取溶劑有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，其中以水和乙醇的安全性最好，通過乙醇-水的比例調(diào)節(jié)可實現(xiàn)對植物總黃酮的高效提取，選擇適宜的干燥、粉碎、輔助提取方式有利于提高魚腥草總黃酮的溶出量與活性。

本研究選擇在超聲波功率200 W下考察固液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度對魚腥草根總黃酮提取率的影響。由圖1可知，魚腥草根總黃酮提取率隨著溶劑的增加而提高，但當(dāng)溶劑增加至70后表現(xiàn)出下降趨勢；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%后，總黃酮提取率提高，且隨著提取時間的延長、提取溫度的升高，總黃酮提取率提高。由表2、表3可知，影響魚腥草根總黃酮提取率的主要因素是固液比，其次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間；魚腥草根總黃酮提取的最優(yōu)工藝組合為A2B2C3D2，即固液比1∶60、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時間35 min、提取溫度55 ℃。驗證試驗表明該工藝穩(wěn)定可行（RSD=1.53%），總黃酮提取率達(dá)2.00%，明顯高于張劍等[13]的研究結(jié)果，這可能主要與試驗材料的來源有關(guān)，魚腥草的品種[9]和種植方式[8，12]均能影響其總黃酮含量與組成。

2.2 體外抗氧化活性評價

2.2.1 ABTS·+清除能力 ABTS·+清除反應(yīng)屬典型的單電子轉(zhuǎn)移途徑，但ABTS·+非生物體內(nèi)自由基，因此ABTS·+清除率常用來定性評價生物樣品的抗氧化能力[12]。本研究利用ABTS粉末與K2S2O8反應(yīng)建立ABTS·+生成體系，然后通過測定OD734 nm來定性評價魚腥草根總黃酮的ABTS·+清除活性。由圖2可知，在65～109 μg/mL范圍內(nèi)，魚腥草根總黃酮的ABTS·+清除率高于同濃度的VC溶液；之后，隨著濃度的升高，魚腥草根總黃酮的ABTS·+清除率漸趨于穩(wěn)定值（90%），略低于同濃度的VC溶液；魚腥草總黃酮的ABTS·+清除活性與濃度之間呈指數(shù)相關(guān)性，其回歸方程為y=6.444 7lnx+80.892（R2=0.967 3），ABTS·+半數(shù)清除率為27.79 μg/mL。這些表明，魚腥草根總黃酮在ABTS·+清除反應(yīng)中具有較強(qiáng)且穩(wěn)定的供電子能力。

2.2.2 ·OH清除能力 生物體內(nèi)的活性氧主要包括O2·-、·OH、H2O2[18]，其中以·OH的化學(xué)性質(zhì)最活潑，對生物體的毒性和危害最大。因此，·OH清除活性是評價功能性食品體外抗氧化能力的重要指標(biāo)。本研究利用Fenton反應(yīng)建立·OH生成體系，然后以水楊酸為·OH捕獲劑，通過分光光度法來監(jiān)測體系中·OH的消除程度。

由圖3可知，不同濃度條件下，魚腥草根總黃酮的·OH清除率均高于VC，其·OH半數(shù)清除率為30.63 μg/mL；魚腥草根總黃酮的·OH清除活性隨著濃度的升高呈線性增強(qiáng)趨勢，其相關(guān)回歸方程為y=5.802 7x+60.991（R2=0.980 8），這與前人研究結(jié)果相似[13，14]。這些研究表明，魚腥草根總黃酮的供氫能力強(qiáng)于VC。魚腥草總黃酮屬總黃酮醇類化合物[6，15，19]，總黃酮醇化合物分子中B-環(huán)酚羥基、C-環(huán)醇羥基的活性均高于VC分子中的烷羥基，從而使魚腥草根總黃酮表現(xiàn)出較強(qiáng)的·OH清除活性。

2.2.3 H2O2清除能力 H2O2是機(jī)體內(nèi)氧化代謝的主要產(chǎn)物，也是一種活性氧，易穿透細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)通過Fenton反應(yīng)生成·OH，進(jìn)而引發(fā)一系列的機(jī)體損傷或破壞[20，21]。本研究中魚腥草根總黃酮提取液的H2O2清除能力檢測結(jié)果見圖4。由圖4可知，試驗范圍內(nèi)魚腥草根總黃酮對H2O2的清除率高于VC，并表現(xiàn)一定的劑量依賴性（y=6.262x+62.349，R2=0.964 2），IC50值為29.01 μg/mL；在327 μg/mL時，魚腥草根總黃酮溶液對H2O2的清除率最高（93.43%），比VC高27.69%。由此可見，H2O2在pH 7.4（正常體液的pH）環(huán)境下表現(xiàn)有較強(qiáng)的氧化性，而魚腥草根總黃酮對H2O2的清除活性明顯高于VC，這暗示了魚腥草根類藥膳有利于緩解和消除機(jī)體的氧化應(yīng)激，恢復(fù)生物體內(nèi)氧化-抗氧化體系的動態(tài)平衡能力，從而實現(xiàn)對機(jī)體損害狀態(tài)的改善和治療[4，22，23]。

2.3 脂質(zhì)過氧化抑制效應(yīng)

2.3.1 亞油酸過氧化抑制活性 細(xì)胞是生物體基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，而細(xì)胞膜中脂肪酸的組成與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對于維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)揮著重要作用[24]。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，活性氧從脂膜中不飽和脂肪酸的亞甲基上奪取活性氫[25]，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[24，26]。亞油酸是人和動物的必需脂肪酸，含有兩個雙鍵，極易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[25，27]，形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物在酸性條件下可使Fe2+氧化為Fe3+，進(jìn)一步反應(yīng)生成紅色的硫氰酸鐵絡(luò)合物。因此，通過對硫氰酸鐵絡(luò)合物在500 nm處吸光度的測定，常用來衡量亞油酸乳化體系中脂質(zhì)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)程。

本研究利用乙醇裂解反應(yīng)產(chǎn)生的·OH來啟動亞油酸的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，然后采用硫氰酸鐵法來觀察魚腥草根總黃酮對亞油酸過氧化反應(yīng)的抑制活性。由圖5可知，在反應(yīng)起始階段，109～327 μg/mL范圍內(nèi)，魚腥草根總黃酮的過氧化抑制活性隨著濃度的增加而增強(qiáng)，脂質(zhì)過氧化抑制率可達(dá)35.71%；加速氧化反應(yīng)24、48 h后，不同濃度的魚腥草根總黃酮溶液對脂質(zhì)過氧化的抑制效應(yīng)相當(dāng)（87.30%～90.96%），且109、163 μg/mL時表現(xiàn)有較高的過氧化抑制活性。而250 μg/mLBHA、水溶性VE在亞油酸乳化體系加速氧化60 h后的過氧化抑制率分別約為88.0%和83.5%[20]。這表明，魚腥草根總黃酮具有較強(qiáng)的供氫能力，能及時清除亞油酸自氧化過程中產(chǎn)生的活性粒子，從而能有效阻斷脂質(zhì)自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

2.3.2 油脂貯藏穩(wěn)定性 油脂是人類膳食和食品工業(yè)的主要原料之一，然而油脂在儲運(yùn)和加工利用過程中極易發(fā)生氧化酸敗，產(chǎn)生氫過氧化物及其分解產(chǎn)物，降低油脂及含油食品的感官品質(zhì)、營養(yǎng)價值和加工性能，并危害人和動物的機(jī)體健康，嚴(yán)重地導(dǎo)致死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失，并給畜產(chǎn)品帶來安全隱患[28]。然而，油脂的氧化穩(wěn)定性因其品種和存放條件的不同而存在差異[29，30]，正確合理地使用抗氧化劑能有效抑制油脂的氧化酸敗。

魚腥草根總黃酮提取液對豬油貯藏穩(wěn)定性的影響見圖6。由圖6可知，隨著貯藏時間的延長，豬油的氧化酸敗程度加劇，72 h時POV為17.88 meq/kg，之后迅速上升至126.54 meq/kg（120 h），POV與貯藏時間之間的曲線擬合方程為y=0.606 2e0.884 2x（R2=0.990 5）；添加魚腥草根總黃酮能有效降低豬油的POV，且與其添加量呈正相關(guān)，當(dāng)魚腥草根總黃酮提取液的添加量達(dá)到0.20%以上時，豬油在65 ℃下存放120 h的POV均不高于13.24 meq/kg，符合GB 10146-2015《食用動物油脂》的要求（POV≤15.76 meq/kg）。研究表明，魚腥草總黃酮對豬油氧化酸敗具有較好的抑制作用，其作用機(jī)理主要是魚腥草總黃酮屬多酚類化合物，可通過B環(huán)-3′、4′-OH和A環(huán)-5-OH供氫來降低脂質(zhì)自由基的活性，并將自身轉(zhuǎn)變?yōu)檩^穩(wěn)定的酯式自由基或半醌雜化物[31]，然后酯式自由基可通過分子內(nèi)電子重排、或半醌雜化物進(jìn)一步與過氧化自由基結(jié)合，形成相對穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而阻斷或抑制油脂的鏈?zhǔn)阶杂苫磻?yīng)；魚腥草總黃酮屬總黃酮醇類化合物，3-OH在阻止油脂自動氧化反應(yīng)時起決定性作用，可聯(lián)合4位羧基與油脂中的金屬離子發(fā)生螯合作用[31，32]，從而消除金屬離子的促氧化作用。

3 結(jié)論

1）在200 W超聲波輔助條件下，魚腥草根總黃酮提取的最佳工藝參數(shù)為固液比1∶60（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時間35 min、提取溫度55 ℃，總黃酮提取率達(dá)2.00%；工藝參數(shù)的影響效應(yīng)依次為固液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間。

2）魚腥草根總黃酮對ABTS·+、·OH和H2O2的清除活性隨著濃度的升高而增強(qiáng)，ABTS·+、·OH和H2O2清除率分別達(dá)89.2%、88.78%、93.43%，IC50分別為27.79、30.63、29.01 μg/mL。

3）魚腥草根總黃酮能有效抑制亞油酸乳化體系中脂質(zhì)自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，提高豬油加速氧化反應(yīng)中的氧化穩(wěn)定性。

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