慢性乙型肝炎患者降鈣素基因相關(guān)肽和α-干擾素-λ4基因多態(tài)性對(duì)α-干擾素治療應(yīng)答的影響*

齊孝安，盧金喜，袁 林

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是世界重要的公共衛(wèi)生問題之一。慢性乙型肝炎(CHB)患者病情遷延反復(fù)，10%～30%患者將發(fā)展為肝硬化，部分患者進(jìn)一步發(fā)展為肝細(xì)胞癌(HCC)[1]。HBV持續(xù)復(fù)制是CHB患者病情進(jìn)展的主要原因，抑制病毒復(fù)制，降低體內(nèi)病毒載量可達(dá)到改善患者預(yù)后的目的[2]。α-干擾素(α-IFN)是目前治療CHB患者的主要藥物之一，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，與核苷(酸)類似物相比，應(yīng)用療程短，不易產(chǎn)生耐藥性，停藥后藥物持續(xù)應(yīng)答時(shí)間長(zhǎng)[3]。臨床上，應(yīng)用α-干擾素治療CHB患者獲得應(yīng)答后患者病情進(jìn)展將得到有效的控制。然而，在治療過程中也有相當(dāng)部分患者不能獲得應(yīng)答，究其原因，除HBV本身生物學(xué)特征和宿主對(duì)HBV免疫狀態(tài)外，宿主相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性也是影響治療應(yīng)答的重要因素[4]。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)存在于感覺神經(jīng)末梢，是一種神經(jīng)肽，對(duì)機(jī)體多個(gè)臟器和系統(tǒng)功能均產(chǎn)生重要的調(diào)節(jié)作用，通過抑制肝星狀細(xì)胞活化發(fā)揮肝臟保護(hù)作用，促進(jìn)肝再生[5]。α-干擾素-λ4(α-interferon-lambda4, IFNL4)能特異性地結(jié)合于異二聚體Ⅱ類細(xì)胞因子受體，具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒功效[6]。本研究探討了CHB患者CGRP和IFNL4基因多態(tài)性對(duì)α-IFN治療療效的影響，旨在為臨床治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年9月～2021年2月我院診治的CHB患者92例，男51例，女41例；年齡為31～61歲，平均年齡為(39.4±8.9)歲；體質(zhì)指數(shù)為18～27 kg/m2，平均為(23.3±1.3)kg/m2。符合《慢性乙型肝炎防治指南》[7]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，血清HBsAg陽(yáng)性超過6個(gè)月以上，血清HBV DNA大于或等于1×105copies /mL，血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)水平分別≥60 U/L，納入初治患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝癌及其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病、合并自身免疫性或血液系統(tǒng)疾病、合并獲得性免疫缺陷綜合征、對(duì)本研究治療藥物過敏、重疊其他肝炎病毒感染、入院治療前3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過其他免疫或抗病毒治療、妊娠或哺乳期婦女。入組對(duì)象簽署知情同意書，本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 給予入組患者注射用重組α-干擾素α-2b(北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S20010074)3～5 MU皮下注射，1次/d，連續(xù)15 d 誘導(dǎo)治療后，隔日注射1次，持續(xù)治療1年。

1.3 療效判定 參照《慢性乙型肝炎防治指南》的療效判定標(biāo)準(zhǔn)[7]，應(yīng)答為治療后血清HBV DNA檢測(cè)不到或下降值>2 lg copies/mL，肝功能指標(biāo)正常。

1.4 血清CGRP和IFNL4基因多態(tài)性檢測(cè) 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)法檢測(cè)CGRP基因rs155209位點(diǎn)及IFNL4基因rs368234815和rs12979860位點(diǎn)多態(tài)性。抽取靜脈血4 mL，與EDTA混合。實(shí)驗(yàn)貝克曼AMPurea XPDNA血液基因組提取試劑盒提取基因組DNA，雙蒸水溶解，經(jīng)純度檢測(cè)合格后，-80℃保存。引物合成由成都合成生物科技有限公司進(jìn)行。CGRP-rs155209：F：5′-GATGCGGCCGAGTGTCT-3′，R：5′-CTCCAGCGAGCGGTAGTG-3′；IFNL4-rs368234815：F：5′-TTCTGTGATTGACCCTGAGCC-3′，R：5′-CTCCGAGCATTGCCTTCC-3′；IFNL4-rs12979860：F：5′-GCGCGGAGTGCAATTCAAC-3′，R：5′-TGTACTGAACCAGGGAGCTC-3′。應(yīng)用Sequenom MassAR-RAY 技術(shù)分型。(1)目的基因擴(kuò)增：取適量的基因組DNA，加入96孔板。取DNA 5 ng、引物2.5 pmol、Taq聚合酶0.1 U、10 mmol/L dNTP 0.5μL。PCR擴(kuò)增：93℃(15 min)，95℃(30 s)，55℃(30 s)，74℃(45 s)，循環(huán)40次，74℃(5 min)；(2)SAP反應(yīng)：加堿性磷酸酶0.3 U，去除剩余的dNTP，35℃(40 min)，84℃(5 min)；(3)單堿基延伸：取5.4 pmol延伸引物、50μmol ldNTP和ddNTP混合物、加Thermosequenase DNA聚合酶0.5 U，94℃(2 min)，94℃(5 s)，55℃(5 s)，74℃(5 s)，循環(huán)35次，72℃(3 min)；(4)用樹脂脫鹽15 min，轉(zhuǎn)移至SpectroCHIP芯片，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)。

1.5 血生化和病毒學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 使用羅氏Light Cycler 480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)血清HBV DNA水平；使用日本OLYMPUS公司AU400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)數(shù)資料以%表示，組間采用卡方檢驗(yàn)；應(yīng)用Logistic回歸分析基因多態(tài)性與α-干擾素治療應(yīng)答的關(guān)系，P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)答組與非應(yīng)答組CGRP和IFNL4基因型和基因頻率分布比較 在治療1年末，應(yīng)答67例(72.8%)，未獲得完全應(yīng)答25例(27.2%)；經(jīng)擬合優(yōu)度卡方檢驗(yàn)，兩組人群CGRP基因rs155209位點(diǎn)及IFNL4基因rs368234815he rs12979860位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡定律(P>0.05)；非應(yīng)答組CGRP-rs155209位點(diǎn)CC基因型和C基因頻率顯著高于應(yīng)答組，而IFNL4-rs368234815位點(diǎn)TT/TT 基因型和T基因頻率顯著低于應(yīng)答組(P<0.05，表1、表2)。

2.2 CGRP和IFNL4基因型與α-干擾素治療應(yīng)答關(guān)聯(lián)分析 應(yīng)用非條件Logistic回歸模型計(jì)算校正性別和年齡，結(jié)果顯示CGRP-rs155209位點(diǎn)CC基因型是影響α-干擾素治療無應(yīng)答的危險(xiǎn)基因型，OR值為1.489(95%CI：1.103～2.009)，而IFNL4-rs368234815位點(diǎn)TT/TT 基因型是α-干擾素治療應(yīng)答的保護(hù)基因型，OR值為0.652(95%CI：0.477～0.893，表3)。

表3 CGRP和IFNL4基因型與α-干擾素治療應(yīng)答關(guān)聯(lián)分析

3 討論

治療CHB的主要目的在于阻止疾病進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌，其中抑制HBV復(fù)制是延緩肝損傷和控制疾病進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[8]。α-干擾素治療以有限療程、確切療效、停藥后復(fù)發(fā)率低等優(yōu)勢(shì)得到臨床醫(yī)生和患者的認(rèn)可[9]。然而，在接受α-干擾素治療的患者中，僅有部分患者對(duì)治療表現(xiàn)出較好的完全應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)生化學(xué)和病毒學(xué)應(yīng)答，另外一部分患者應(yīng)答效果差[10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)抗病毒療效可能與多種免疫學(xué)應(yīng)答基因存在關(guān)聯(lián)。

CGRP基因位于11號(hào)染色體短臂，包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子[11]。CGRP是神經(jīng)細(xì)胞分泌的免疫活性物質(zhì)，于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，各種組織中均呈現(xiàn)多樣生理效應(yīng)，參與炎癥過程，控制免疫應(yīng)答，在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。通過肝臟血管擴(kuò)張改善肝臟血液循環(huán)，降低肝臟脂質(zhì)過氧化物，預(yù)防缺血再灌注導(dǎo)致的肝臟損傷[12]。相關(guān)研究表明[13，14]，CGRP可減輕CHB患者肝纖維化。CGRP及其受體是治療CHB的有效靶點(diǎn)。本研究對(duì)CGRP基因rs155209位點(diǎn)基因多態(tài)性與接受α-干擾素治療的CHB患者應(yīng)答進(jìn)行了研究。本研究應(yīng)答組rs155209位點(diǎn)TT和CT基因型占比顯著高于非應(yīng)答組，提示CC基因型是α-干擾素治療的CHB患者無應(yīng)答的危險(xiǎn)基因型，其治療無應(yīng)答風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到TT/CT基因型患者的1.332倍。分析可能的原因，我們認(rèn)為rs155209位點(diǎn)T→C轉(zhuǎn)換影響了CGRP的正常合成，從而影響CHB患者免疫應(yīng)答修復(fù)，不利于機(jī)體清除病毒[14，15]。

IFNL4基因位于19號(hào)染色體，包括4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子，其編碼的干擾素λ4蛋白通過激活JAK-STAT通路產(chǎn)生抗病毒活性[16，17]。本研究分析IFNL4基因rs368234815和rs12979860位點(diǎn)基因多態(tài)性與CHB患者接受α-干擾素治療應(yīng)答的關(guān)系。rs368234815的二核苷酸突變體，即rs368234815(TT/△G)位于19號(hào)染色體q13.13內(nèi)的IFNL3基因上游[18]。本研究應(yīng)答組與未應(yīng)答組rs368234815 TT/TT 型所占比例分別為92.5%和76.0%，兩組各僅有1例ΔG/ΔG型患者。本研究發(fā)現(xiàn)IFNL4 rs368234815位點(diǎn) TT/TT 型是CHB患者接受α-干擾素治療應(yīng)答的保護(hù)基因型，未應(yīng)答組ΔG/ΔG和TT/ΔG基因型比例顯著高于TT/TT 型，推測(cè)攜帶IFNL4 ΔG基因者細(xì)胞分泌IFN-λ4蛋白，但分泌能力并不強(qiáng)，病毒感染觸發(fā)肝組織IFN-λ4蛋白弱表達(dá)，無法有效抑制病毒感染[19，20]。有研究發(fā)現(xiàn)，IFNL4-rs368234815位點(diǎn)TT/TT 型患者在接受α-干擾素治療后血清HBV DNA水平顯著低于TT/CT基因型患者，血清ALT和AST水平顯著低于TT/ΔG和ΔG/ΔG型患者，治療后生化學(xué)和病毒學(xué)應(yīng)答率較高。本研究應(yīng)答組與非應(yīng)答組rs12979860位點(diǎn)基因分布無顯著性差異，rs12979860位點(diǎn)基因多態(tài)性不影響α-干擾素治療后的應(yīng)答。IFNL4對(duì)CHB患者接受α-干擾素治療后應(yīng)答的影響機(jī)制較為復(fù)雜。眾多基因參與了α-干擾素治療應(yīng)答反應(yīng)，而單獨(dú)基因的作用可能較小。本研究的不足之處在于未比較不同病毒載量的CHB患者CGRP和IFNL4基因型的差異，它們是否對(duì)α-干擾素治療應(yīng)答產(chǎn)生影響，也需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，CGRP基因rs155209位點(diǎn)CC基因型是CHB患者接受α-干擾素治療無應(yīng)答的危險(xiǎn)基因型，而IFNL4基因rs368234815 位點(diǎn)TT/TT 基因型是α-干擾素治療應(yīng)答的保護(hù)基因型，影響著CHB患者在α-干擾素治療后生化學(xué)和病毒學(xué)應(yīng)答反應(yīng)。臨床上，可針對(duì)性地篩選出可能獲得更高抗病毒治療效果的人群給予個(gè)體化的抗病毒治療，是否能提高治療效果，需要認(rèn)真研究。