利用SRAP標(biāo)記分析日本落葉松2代優(yōu)樹的遺傳多樣性

汪成成

（遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

利用SRAP標(biāo)記分析日本落葉松2代優(yōu)樹的遺傳多樣性

汪成成

（遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

為研究日本落葉松2代優(yōu)樹間的遺傳多樣性，該文利用SRAP分子標(biāo)記的方法對(duì)選擇的80個(gè)樣本進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：篩選出的8對(duì)引物共擴(kuò)增出235條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶223條，多態(tài)性百分率為94.89%，每對(duì)引物可擴(kuò)增出20～37條多態(tài)性條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)為29.4條。利用UPGMA法進(jìn)行聚類，當(dāng)相似系數(shù)為0.824時(shí)將80個(gè)日本落葉松種質(zhì)材料劃分為4個(gè)類群。聚類基本與子一代的親緣關(guān)系符合，類群間遺傳基礎(chǔ)較狹窄，親緣關(guān)系較近，為日后建立日本落葉松2代種子園的工作提供了理論依據(jù)。

日本落葉松；2代優(yōu)樹；遺傳多樣性；SRAP

日本落葉松Larix kaempferi系松科落葉松屬喬木，因其適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、材質(zhì)好、用途廣，生長(zhǎng)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)地超過(guò)了鄉(xiāng)土樹種長(zhǎng)白落葉松和華北落葉松，已成為我國(guó)北方地區(qū)引種最成功的造林樹種之一。日本落葉松的苗木主要是靠種子園或母樹林產(chǎn)種獲得，日本落葉松優(yōu)樹選擇和初級(jí)種子園營(yíng)建工作早在1963年就開(kāi)始了，但是初級(jí)種子園是按表型選擇的優(yōu)株建成的。由于選優(yōu)林地生態(tài)環(huán)境條件較復(fù)雜，造成表型選擇誤選率較高，不經(jīng)子代測(cè)定就全部納入種子園的構(gòu)建，不可避免地影響了種子園的總體遺傳水平。以往主要是依靠子代測(cè)驗(yàn)來(lái)評(píng)估種子園遺傳增益，由于組成種子園優(yōu)樹的不同，這種評(píng)價(jià)往往不能真實(shí)地體現(xiàn)種子園的總體遺傳水平，對(duì)于種質(zhì)資源保護(hù)和遺傳改良都非常不利[1-2]。本研究欲通過(guò)SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)日本落葉松2代優(yōu)樹的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，力求在日本落葉松2代種子園的建成中，既獲得較高的遺傳增益，又具有較高的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 樣 品

供試的80個(gè)日本落葉松樣品均采自遼寧省撫順市清原縣大孤家國(guó)營(yíng)林場(chǎng)日本落葉松2代優(yōu)樹，采集后用錫紙包裹，然后在錫紙上編號(hào)，投入液氮罐后及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于－80℃超低溫冰箱中備用。80個(gè)供試材料的基本情況見(jiàn)表1。

表1 日本落葉松的供試材料

1.2 DNA提取與檢測(cè)

采用CTAB法提取DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度與純度，取部分基因組DNA稀釋到50 ng·μL-1，保存于－20℃的冰箱內(nèi)備用。

1.3 SRAP擴(kuò)增與檢測(cè)

SRAP分子標(biāo)記的引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成生產(chǎn)，本試驗(yàn)所用的引物序列見(jiàn)表2。SRAP-PCR反應(yīng)總體積為25 μL，其中模板DNA 2 μL，引物0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18.5 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 m in；94℃變性1 m in，35℃退火1 m in，72℃延伸1 m in，一共循環(huán)5次；然后4℃變性1 m in，35℃退火，72℃延伸1 min，一共循環(huán)35次；最后72℃延伸10 m in，4℃保存。PCR產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠于150 V的恒壓下電泳，電泳后通過(guò)固定、銀染、顯影后拍照分析。

表2 SRAP引物代號(hào)及序列

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)引物對(duì)供試材料所擴(kuò)增的清晰可辨的總帶數(shù)，按DNA條帶的有或無(wú)賦值，有記為“1”，無(wú)記為“0”，構(gòu)建二維數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)SRAP擴(kuò)增的結(jié)果，利用NTSYS-pc version 2.1軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)的“0/1”數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析，得到Dice相似性系數(shù)，并利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP標(biāo)記的遺傳多態(tài)性分析

經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，從64對(duì)引物組合中篩選出8對(duì)擴(kuò)增條帶清晰且數(shù)目較多、多態(tài)性高、重復(fù)性較好的引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段大部分集中在70～220 bp，其中ME6-EM 8組合的擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖1-3。

圖1 引物組合M 6E8對(duì)21-40號(hào)日本落葉松DNA的擴(kuò)增結(jié)果

圖2 引物組合M 6E8對(duì)41-70號(hào)日本落葉松DNA的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 引物組合M 6E8對(duì)71-100號(hào)日本落葉松DNA的擴(kuò)增結(jié)果

8對(duì)SRAP引物擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。8對(duì)SRAP引物共擴(kuò)增出235條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶223條，多態(tài)性百分率94.89%，每對(duì)引物可擴(kuò)增出20～37條多態(tài)性條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)29.4。這些統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，供試的日本落葉松材料之間存在著豐富的遺傳多樣性。

表3 SRAP引物組合擴(kuò)增帶數(shù)及多態(tài)性帶數(shù)

2.2 基于SRAP標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)分析

利用NTSYS-pc version2.1軟件對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行相似系數(shù)計(jì)算，得到SRAP標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果的相似性系數(shù)矩陣。SRAP擴(kuò)增結(jié)果的遺傳相似性在0.791 1～0.917 2，其中編號(hào)為31和80的遺傳相似系數(shù)最低為0.791 1（圖4），表明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；編號(hào)為78和79的遺傳相似系數(shù)最高為0.917 2（圖5），表明二者親緣關(guān)系最近。從整個(gè)相似性系數(shù)來(lái)看，變幅為0.126 1，表明所選材料之間的差異不是很明顯。相似性系數(shù)越大，遺傳距離越小，說(shuō)明兩者之間的親緣關(guān)系越親近；反之亦然。從結(jié)果看所選材料差異較明顯，具有較豐富的遺傳多樣性，這也是日本落葉松種質(zhì)資源多樣性的分子基礎(chǔ)。

圖4 SRAP標(biāo)記中包含編號(hào)31和80的部分供試材料之間的相似性系數(shù)

圖5 SRAP標(biāo)記中包含編號(hào)78和79的部分供試材料之間的相似性系數(shù)

2.3 基于SRAP標(biāo)記的聚類分析

基于日本落葉松SRAP遺傳相似性系數(shù)，利用UPGMA法進(jìn)行聚類，獲得聚類樹狀圖（圖6）。當(dāng)相似系數(shù)為0.824時(shí)，可將80個(gè)日本落葉松種質(zhì)材料劃分為4個(gè)類群。類群Ⅰ包括46個(gè)樣本材料，該類群在相似系數(shù)為0.844時(shí)又可以劃分為4個(gè)亞類群，其中亞類群Ⅰ-1包括19個(gè)樣本材料；亞類群Ⅰ-2只有編號(hào)為25這1個(gè)樣本材料；亞類群Ⅰ-3包括24個(gè)樣本材料；亞類群Ⅰ-4只有編號(hào)為63和66這2個(gè)樣本材料。類群Ⅱ包括30個(gè)樣本材料，類群Ⅲ和類群Ⅳ分別只有2個(gè)樣本材料。從劃分的類群可以看出，所選的80份日本落葉松樣本間的遺傳基礎(chǔ)較狹窄，親緣關(guān)系比較近。

3 結(jié)論與討論

SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）[3]是由美國(guó)加州大學(xué)作物系LI和QUIROS博士[4]在2001年提出來(lái)的，這項(xiàng)標(biāo)記技術(shù)是一種無(wú)需任何序列信息即可直接PCR擴(kuò)增的新型分子標(biāo)記技術(shù)[5]。因其具有操作簡(jiǎn)便、多態(tài)性強(qiáng)、中等產(chǎn)量、易于分離條帶及測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析[6-10]、性狀的標(biāo)記[11]、基因定位及QTL分析、基因克隆、遺傳圖譜構(gòu)建[12]等領(lǐng)域。顧曉燕[13]等利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來(lái)自亞洲的84份老芒麥種質(zhì)的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示23個(gè)引物組合共產(chǎn)生337條擴(kuò)增條帶，其中多態(tài)性條帶為203條，多態(tài)性比率為60.24%，在GS=0.84時(shí)，將供試種質(zhì)劃分成2個(gè)明顯不同的組群。陳大霞[14]等利用SRAP分子標(biāo)記的方法對(duì)12個(gè)不同來(lái)源地的大黃進(jìn)行遺傳關(guān)系的分析，24對(duì)引物組合共擴(kuò)增出272條條帶，其中有199條為多態(tài)性條帶，占73.2%，遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.578 4～0.941 6。李杰勤[15]等利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)20個(gè)黑麥草品系的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)53個(gè)引物組合共擴(kuò)增出705條條帶，其中多態(tài)性條帶共597條，多態(tài)性比率為78.95%，以閾值為0.63時(shí)可將這20個(gè)品系分為4類。目前許多學(xué)者的研究證明SRAP是一項(xiàng)能夠揭示種質(zhì)間遺傳多樣性的有效的分子標(biāo)記技術(shù)。

圖6 80個(gè)日本落葉松SRAP聚類圖

利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)分析日本落葉松2代優(yōu)樹遺傳多樣性，結(jié)果表明篩選出的8對(duì)引物共擴(kuò)增出235條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶223條，多態(tài)性百分率為94.89%，每對(duì)引物可擴(kuò)增出20～37條多態(tài)性條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)為29.4條。利用UPGMA法進(jìn)行聚類，當(dāng)相似系數(shù)為0.824時(shí)將80個(gè)日本落葉松種質(zhì)材料劃分為4個(gè)類群。聚類基本符合與子一代的親緣關(guān)系，類群間遺傳基礎(chǔ)較狹窄，親緣關(guān)系較近，為日后建立日本落葉松2代種子園的工作提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：張素清）

Analysis of genetic diversity of second-generation tree of Larix kaempferi by SRAP

WANG Chengcheng
（Liaoning Academy of Forestry Science，Shenyang 10032，China）

In this study，we used SRAP molecular marker technology to analyze genetic diversity among 80 populations of second-generation tree of Larix kaempferi.The result showed that 8 SRAP primers amplified 235 DNA bands，223 polymorphism bands among these，the polymorphic percentage was 94.89%.Each pair of primers can amplify the article 20 to 37 polymorphism bands,the average number of polymorphic bands was 29.4.Using UPGMA method for clustering,when the similarity coefficient of 0.824,80 materials of Larix kaempferi were divided into four groups.Clustering in line w ith and son generation of genetic relationship,between groups they had a narrow genetic basis and a close genetic relationship,it provided a theoretical basis to set up the second generation seed orchard of Larix kaempferi in the future work.

Larix kaempferi；Second-generation tree；genetic diversity；SRAP

S791.223

A

1001-1714（2017）02-0019-07

2016-11-25

國(guó)家“十二五”科技支撐項(xiàng)目（2012BAD01B01）。

汪成成（1985-），女，工程師，現(xiàn)從事森林培育研究。E-mail：yuanlinwcc@163.com。