牦牛衣原體滅活疫苗免疫試驗(yàn)研究

闞 威 蔡金山 晁易林 胡廣衛(wèi) 沈艷麗 趙全邦 河生德李 靜 王曉潤 王小紅 李兆才 周繼章

（①青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 西寧 810000 ②青海省海晏縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心③青海省貴南縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心④中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅 蘭州）

牦牛衣原體滅活疫苗免疫試驗(yàn)研究

闞 威①蔡金山①晁易林①胡廣衛(wèi)①沈艷麗①趙全邦①河生德②李 靜①王曉潤①王小紅③李兆才④周繼章④

（①青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 西寧 810000 ②青海省海晏縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心③青海省貴南縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心④中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅 蘭州）

為了解牦牛衣原體滅活疫苗在牦牛免疫后的抗體消長規(guī)律，本試驗(yàn)在青海省兩個(gè)示范縣貴南和海晏分別選擇2個(gè)規(guī)模養(yǎng)殖戶，篩選成年牦牛120頭(40頭未孕牛、80頭懷孕牛)、犢牛各40頭進(jìn)行免疫試驗(yàn)。試驗(yàn)牛群于免疫后第7天、21、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330天采血后分離血清，采用間接血凝試驗(yàn)檢測免疫后抗體效價(jià)。結(jié)果表明：免疫后第21天的抗體效價(jià)成年牛高于1∶256，犢牛高于1∶1024；免疫后90d內(nèi)，抗體水平處于上升狀態(tài)。免疫后第4～8個(gè)月抗體水平保持平穩(wěn)時(shí)，第8個(gè)月，抗體水平開始下降，但仍成年牛和犢牛抗體滴度仍保持在1∶256的效價(jià)。由此可見，該疫苗免疫牦牛后免疫抗體產(chǎn)生早、效價(jià)高、持續(xù)期長，效果明顯，對(duì)牦牛衣原體病可達(dá)到預(yù)防的效果。

衣原體 滅活疫苗 免疫效果

衣原體歸于衣原體科衣原體屬，流產(chǎn)嗜性衣原體是衣原體屬的一個(gè)種，可導(dǎo)致多種動(dòng)物共患的人畜共患病，它在動(dòng)物界廣泛流行。該病原體主要寄生在母畜的胎盤滋養(yǎng)層，可導(dǎo)致綿羊、山羊、牛胎兒流產(chǎn)，此外還可引起豬、馬、兔、豚鼠、小鼠的流產(chǎn)。經(jīng)研究確定，牦牛衣原體病是由流產(chǎn)嗜性衣原體感染牦牛引起的一種地方流行性的接觸性傳染病[1]，以妊娠母牛流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)或產(chǎn)無活力犢牛為主要特征。根據(jù)2010年到2013年監(jiān)測，青海省牦牛衣原體病血清學(xué)陽性率逐年升高，臨床上流產(chǎn)率也隨之逐年升高，危害日益嚴(yán)重。2013年4～5月貴南縣塔秀鄉(xiāng)牦牛發(fā)生暴發(fā)流產(chǎn)現(xiàn)象，血清陽性率58.5%；收集的14份流產(chǎn)物衣原體病原陽性11份，并分離到6株衣原體菌株[1]。2015年，胡廣衛(wèi)等[2]，在海晏、貴南、烏蘭、玉樹四縣市，對(duì)往年流產(chǎn)嚴(yán)重的牛群進(jìn)行血清學(xué)檢測，四縣合計(jì)檢測859份，平均陽性率55.76%；4縣共調(diào)查8個(gè)鄉(xiāng)16個(gè)村的104個(gè)流產(chǎn)嚴(yán)重牛群的流產(chǎn)率，平均流產(chǎn)率高達(dá)22.0%。

本試驗(yàn)旨在了解牦牛衣原體滅活疫苗免疫牦牛的效果，為疫苗的推廣使用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)疫苗 牦牛衣原體滅活疫苗由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所和青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心合作研發(fā)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)動(dòng)物初始感染狀態(tài)篩查，采集所有試驗(yàn)動(dòng)物的血清，做IHA檢測感染抗體。選擇衣原體感染抗體陰性牦牛作為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組，包括成年牦牛、妊娠牦牛和牦牛犢的對(duì)照組，不同劑量免疫組，及免疫+攻毒組等。在貴南縣、海晏縣選擇有流產(chǎn)現(xiàn)象的牛群免疫牦牛6000頭。海晏縣2群、貴南縣2群牦牛進(jìn)行衣原體疫苗牦牛衣原體本動(dòng)物疫苗安全性試驗(yàn)、疫苗的最小免疫劑量試驗(yàn)、疫苗的免疫效力試驗(yàn)、疫苗的免疫抗體消漲規(guī)律研究試驗(yàn)。

1.1.3 檢測試劑 衣原體病間接血凝(IHA)抗體檢測試劑盒，生產(chǎn)批號(hào)150430，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 牦牛衣原體滅活疫苗的制備 制備方法參照邱昌慶、周繼章等[3]發(fā)表的文章進(jìn)行制備。

1.2.2 疫苗安全性試驗(yàn) 在海晏縣青海湖鄉(xiāng)和甘子河鄉(xiāng)實(shí)施。對(duì)斷乳牦牛犢10頭(2ml/頭)和懷孕2個(gè)月以內(nèi)母牦牛95頭(4ml/頭)，進(jìn)行單一劑量接種安全性檢驗(yàn)；對(duì)斷乳牦牛犢6頭(4ml/頭)和懷孕2個(gè)月以內(nèi)母牦牛20頭(6ml/頭)，進(jìn)行超劑量接種安全性檢驗(yàn)。檢驗(yàn)是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，是否引起流產(chǎn)。

1.2.3 疫苗的免疫效力試驗(yàn) 選擇經(jīng)過免疫的成年牦牛5頭、妊娠牦牛30頭和5頭犢牛，第21天，用1∶1、1∶10、1∶100倍稀釋的衣原體疫苗種毒稀釋液攻毒，檢測免疫效力。

1.2.4 疫苗的最小免疫劑量試驗(yàn) 在海晏縣甘子河鄉(xiāng)實(shí)施。成年牦牛免疫1、2、4ml/頭各免疫10頭，共30頭；犢牦牛免疫0.5、1、2ml/頭各免疫10頭，共30頭，檢測免疫保護(hù)力。通過本試驗(yàn)可給出一個(gè)合適的臨床使用劑量。

1.2.5 疫苗的免疫抗體消漲規(guī)律研究試驗(yàn) （1）分組及試驗(yàn)設(shè)計(jì)：將試驗(yàn)研究分為2個(gè)組，犢牛免疫組和成年牛免疫組。犢牛組和成年牛組免疫試驗(yàn)。自免疫后第7天間接血凝試驗(yàn)開始檢測免疫抗體。（2）采血及血清制備。在免疫后第7、21、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330天，靜脈采血，靜置析出血清，將血清注入EP管內(nèi)，-20℃保存待檢。（3）抗體檢測：按說明書要求：①鋪板：用移液槍移取被檢血清0.025ml加入第1孔，呈4倍遞增稀釋8孔(即1∶4～1∶65536)。第3孔棄去0.025ml，孔內(nèi)液體量扔為0.075ml。同一板上同時(shí)設(shè)陽性、陰性和空白對(duì)照各孔。②加抗原：每孔內(nèi)加稀釋好的抗原0.025ml，置微型振蕩器上振蕩2min，蓋上玻璃板在37℃作用2h判定結(jié)果。（4）結(jié)果判定：根據(jù)血凝結(jié)果，8孔凡紅細(xì)胞沉積于孔底，集中呈1圓點(diǎn)的為不凝集，判為陰性。如紅細(xì)胞凝集，則分布于孔底周圍。根據(jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱，以抖凝集的孔為滴度終點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 疫苗的安全性

按試驗(yàn)所需劑量免疫后觀察，連續(xù)3天測定體溫、脈搏、呼吸，所有指標(biāo)均正常，未發(fā)生流產(chǎn)現(xiàn)象，無任何不良反應(yīng)。證明牦牛衣原體滅活疫苗安全可靠。

2.2 疫苗的免疫效力

試驗(yàn)結(jié)果表明30頭妊娠牦牛未發(fā)生流產(chǎn)，保護(hù)率達(dá)到100%。成年牦牛和犢牦牛無任何不良反應(yīng)。

2.3 疫苗的最小免疫劑量

圖1 成年牦牛最小免疫劑量試驗(yàn)

結(jié)果表明：經(jīng)免疫抗體檢測，牦牛犢1ml免疫劑量、成年牦牛2ml免疫劑量就可以達(dá)到理想免疫效果。檢測結(jié)果如下圖1、圖2所示：

圖2 犢牦牛最小免疫劑量試驗(yàn)

2.4 疫苗的免疫抗體消漲規(guī)律

免疫后免疫采集第7、14、21、30、60～330天用間接血凝試驗(yàn)方法進(jìn)行血清抗體的檢測。試驗(yàn)結(jié)果：免疫后第21天，平均免疫抗體滴度達(dá)到1∶S256以上，至2015年7月，免疫抗體檢測到210d，平均免疫抗體滴度達(dá)到1∶256以上，至2016年1月，免疫抗體檢測到330d，平均免疫抗體滴度達(dá)到1∶64。疫苗免疫效果非常理想。

3 討論與小結(jié)

（1）牦牛衣原體病是導(dǎo)致牧區(qū)牦牛流產(chǎn)的主要病之一，它的自然傳播方式目前還不清楚。病牛和隱性帶菌者是主要的傳染源。牧區(qū)牛羊之間的相互傳播也有可能。患病懷孕牛流產(chǎn)或產(chǎn)犢時(shí)，大量衣原體會(huì)隨羊水排出體外污染環(huán)境，通過消化道和呼吸道感染其他健康牛[4]。青海省牦牛存欄量約570萬頭，占世界牦牛的三分之一多。牦牛產(chǎn)業(yè)是我省牧民賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)和支柱產(chǎn)業(yè)，通過牦牛衣原體病滅活疫苗的研制和推廣，采取免疫預(yù)防等綜合防治，降低牦?？諔崖屎土鳟a(chǎn)率，提高仔畜成活率，保障牦牛產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。（2）目前我省牧區(qū)的牦牛衣原體病感染和危害日趨嚴(yán)重，全省普遍需要防治衣原體病，但是缺乏有效的防治疫苗和方法，全世界沒有牦牛上使用的疫苗，這是牦牛衣原體病得不到有效防治的最根本的原因，牦牛衣原體病已成為影響牦牛正常繁殖和牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。本疫苗的成功研制為我省牦牛衣原體病的有效控制和牦牛養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了技術(shù)支持。（3）經(jīng)測試，本疫苗給懷孕2個(gè)月以內(nèi)的乳牛使用安全可靠。而妊娠牦牛在懷孕早期(60d內(nèi))比較容易感染衣原體，為了有效預(yù)防衣原體病，以在配種前1個(gè)月或配種后1個(gè)月內(nèi)接種效果較好。根據(jù)牦牛牛衣原體病的流行特點(diǎn)以及疫苗免疫期和疫苗接種后動(dòng)物體內(nèi)抗體的消長規(guī)律，本疫苗的最佳接種程序是：繁殖母牛在配種前1個(gè)月或配種后1個(gè)月免疫；犢牛在斷乳后l個(gè)月內(nèi)免疫。

[1] Zhaocai Li, Yilin Chao, Jinshan Cai et al.Identification and Characterization of Chlamydia abortus Isolates from Yaks in Qinghai, China [J]. Volume 2015 (2015), Article ID 658519, 6 pages

[2] 胡廣衛(wèi), 沈艷麗, 晁宜林等. 青海省牛羊衣原體病血清學(xué)調(diào)查[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2015,12∶ 101-102.

[3] 邱昌慶, 周繼章, 程淑敏等. 乳牛衣原體病滅活疫苗的研制[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué),2006,05∶ 343-347.

[4] Ehret W J, Schutte A P, Pienaar J G,et al. Chlamydiosis in abeef herd[J]. S Afr Vet Assoc，1975, 46(2)∶ 171-179.

S852.67

A

1007-1733(2017)06-0010-02

2017–02–21）

青海省科技廳項(xiàng)目《牦牛衣原體滅活疫苗研究與推廣》

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