綠僵菌菌劑培養(yǎng)及田間生物防治研究

摘 要：綠僵菌作為重要的生物農(nóng)藥制劑，研究及應(yīng)用非常廣泛。本研究通過試驗探索了固體培養(yǎng)綠僵菌L8500-2x菌株的最佳培養(yǎng)基配方及工藝條件，進行了田間試驗示范推廣，為有效利用綠僵菌進行田間合理的防治提供了科學參考。

關(guān)鍵詞：綠僵菌；菌劑培養(yǎng)；生物防治

中圖分類號：S476.1 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170533028

綠僵菌（Metarhizium anisopliae）是重要的昆蟲病原真菌之一[1]，將其作為主要生物活性成分的制劑，具有不污染環(huán)境、無殘留、易生產(chǎn)、致病力強、持效期長、應(yīng)用效果好、對非靶標生物安全等優(yōu)點，其寄主范圍廣，可在8目30科200余種農(nóng)林害蟲上寄生，其應(yīng)用前景非常廣闊[2，3]。近年來，由于化學農(nóng)藥的大量使用，食品安全和健康問題、環(huán)境保護問題倍受重視，生物農(nóng)藥的研發(fā)及推廣具有深刻意義[4]。

目前，綠僵菌生物農(nóng)藥的生產(chǎn)普遍采用液固雙相發(fā)酵工藝，其固體載體多為大米和稻殼，國外綠僵菌生產(chǎn)的固體載體多為稻米[5]。綠僵菌制劑的劑型主要有粉劑、可濕性粉劑等，其助劑的成分和配比是當前研究熱點。本研究為了大量生產(chǎn)綠僵菌菌劑用于田間農(nóng)作物害蟲的防治，先采用液體發(fā)酵培養(yǎng)綠僵菌L8500-2x菌劑，再采用固體發(fā)酵培養(yǎng)綠僵菌L8500-2x菌粉，進行田間試驗示范推廣，可為有效利用綠僵菌防治農(nóng)作物病害提供參考，為適應(yīng)綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展要求，減少高毒、高殘留化學農(nóng)藥的使用提供科學方法。

1 試驗材料與方法

1.1 綠僵菌L8500-2x菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)載體的篩選

1.1.1 試驗材料

綠僵菌培養(yǎng)載體：麥麩、硅藻土、磷酸鈣、鋸末、谷糠、玉米粉；試驗害蟲是菜青蟲2代幼蟲。

1.1.2 試驗方法[6]

利用麥麩、硅藻土、磷酸鈣、鋸末、谷糠、玉米粉等廉價物質(zhì)作為基質(zhì)進行綠僵菌L8500菌劑的生產(chǎn)，觀察不同供試載體對綠僵菌菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率的影響，經(jīng)對比試驗，確定固體培養(yǎng)綠僵菌L8500-2x菌種的最佳培養(yǎng)基配方及工藝條件[7]。

1.2 綠僵菌L8500-2x菌劑田間生物防治試驗

1.2.1 綠僵菌L8500-2x菌劑防治

馬鈴薯28星瓢蟲藥效試驗。

1.2.1.1 供試藥劑

綠僵菌L8500-2x菌劑13.5L（山西省醫(yī)藥與生命科學研究院提供）、清水。

1.2.1.2 防治對象

馬鈴薯28星瓢蟲第1代幼蟲。

1.2.1.3 試驗點基本情況

試驗點設(shè)在山西靜樂縣王村鄉(xiāng)善應(yīng)村，屬黃土丘陵區(qū)，馬鈴薯品種為紫花白。

1.2.1.4 試驗時間

2009年7月10日，這個時期是第1代幼蟲為害盛期。

1.2.1.5 試驗處理

試驗設(shè)綠僵菌（L8500-2x）10倍菌劑、20倍菌劑及清水對照共3個處理。試驗每處理重復(fù)3次，共9個小區(qū)，小區(qū)隨機組排列，小區(qū)面積667m2，試驗面積共6003m2。

1.2.1.6 試驗方法

將綠僵菌（L8500-2x）菌劑稀釋10倍、20倍，用手動噴霧器均勻噴霧，藥液用量為30L/667m2（稀釋后）。

1.2.1.7 調(diào)查記錄和計算方法[8]

認真調(diào)查藥后1d、3d、5d、7d各處理小區(qū)的殘存數(shù)量（頭/百株），調(diào)查采用對角線5點取樣法，每點查100株，算出平均數(shù)，并詳細記錄。計算防效，其公式為：

1.2.2 綠僵菌L8500-2x菌劑防治土蝗田間藥效試驗

1.2.2.1 供試藥劑

綠僵菌（L8500-2x）菌劑（山西省醫(yī)藥與生命科學研究院提供）40.5L、清水。

1.2.2.2 防治對象

蝗蝻（1～2齡）。

1.2.2.3 試驗點基本情況

試驗點設(shè)在靜樂縣段家寨鄉(xiāng)永安鎮(zhèn)村草灘，該地區(qū)是土黃重發(fā)區(qū)。

1.2.2.4 試驗時間

2009年6月25日，這時蝗蝻大部分為1～2齡。

1.2.2.5 試驗處理

試驗共設(shè)3個大區(qū)，每個試驗大區(qū)設(shè)綠僵菌L8500-2x菌劑10倍、20倍稀釋液及清水對照共3個處理。每處理重復(fù)3次，共9個小區(qū)，小區(qū)隨機組排列，小區(qū)面積667m2。該實驗共27個小區(qū)，面積18009 m2。

1.2.2.6 試驗方法[9]

小區(qū)提前10d用紗網(wǎng)圍嚴實，保證小區(qū)內(nèi)蝗蝻不遷移。將L8500菌劑按10倍、20倍稀釋后，用手動噴霧器對各處理小區(qū)均勻噴霧防治，藥液用量為30L/667m2（稀釋后）。

1.2.2.7 調(diào)查記錄和計算方法

調(diào)查藥后3d、5d、7d各處理小區(qū)的蟲口密度，并詳細記錄在表，計算防效，其公式為：

防效=×100%

1.2.3 固體培養(yǎng)綠僵菌L8500-2x菌粉防治土蝗田間試驗

1.2.3.1 供試藥劑

固體培養(yǎng)的綠僵菌L8500-2x菌粉（山西省醫(yī)藥與生命科學研究院提供）9kg、菌液9L及清水。

1.2.3.2 防治對象

蝗蝻（1～2齡）。

1.2.3.3 試驗點基本情況

試驗點設(shè)在靜樂縣段家寨鄉(xiāng)永安鎮(zhèn)村草灘，該地區(qū)是土黃重發(fā)區(qū)。

1.2.3.4 試驗時間

2010年7月5日。

1.2.3.5 試驗處理

試驗共設(shè)綠僵菌L8500-2x菌劑10倍稀釋液、固體培養(yǎng)L8500菌粉10倍稀釋液及清水對照共3個處理。每處理重復(fù)3次，共9個小區(qū)，小區(qū)隨機組排列，小區(qū)面積667m2，面積6003m2。

1.2.3.6 試驗方法

小區(qū)提前10d用紗網(wǎng)圍嚴實，保證小區(qū)內(nèi)蝗蝻不遷移。將菌液10倍稀釋，藥液用量為30L/667m2（稀釋后）；L8500-2x菌粉用水10倍稀釋，藥粉用量為3kg/667m2，用手動噴霧器對各處理小區(qū)均勻噴霧防治。

1.2.3.7 調(diào)查記錄和計算方法

調(diào)查藥后3d、5d、7d各處理小區(qū)的蟲口密度（頭/m2），并詳細記錄在表，計算防效，其公式為：

防效=×100%

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 綠僵菌L8500-2x菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)載體的篩選結(jié)果與分析

表1實驗結(jié)果可以看出，供試載體對綠僵菌菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率都有影響，以硅藻土+谷糠+玉米粉對孢子活力保護最好，其次為硅藻土、碳酸鈣、高嶺土+稻殼+玉米粉，與對照相比其孢子萌發(fā)率、產(chǎn)孢量差異顯著。

以硅藻土+谷糠+玉米粉、高嶺土+稻殼+玉米粉2組供試載體為基礎(chǔ)，選出3種固體培養(yǎng)綠僵菌L8500菌種的培養(yǎng)基配方，經(jīng)對比試驗，確定了固體培養(yǎng)綠僵菌L8500-2x菌種的最佳培養(yǎng)基配方及工藝條件。

培養(yǎng)基配比1：葡萄糖1%，硅藻土40%，谷糠25%，玉米粉15%，加水19%，裝袋中。

培養(yǎng)基配比2：葡萄糖1%，高嶺土40%，稻殼25%，玉米粉15%，加水19%，裝袋中。

培養(yǎng)基配比3：葡萄糖1%，硅藻土45%，谷糠15%，麥麩10%，玉米粉10%，加水19%，裝袋中。

經(jīng)方差分析，試驗處理組間存在差異不顯著P >0.05。但從應(yīng)用效果及成本綜合考慮，選用培養(yǎng)基配比三既經(jīng)濟又合理，且防效率達到80.4%。

經(jīng)對比試驗，確定了固體培養(yǎng)綠僵菌L8500-2x菌株的最佳培養(yǎng)基配方及工藝條件。培養(yǎng)基配比：葡萄糖1%，硅藻土45%，谷糠15%，麥麩10%，玉米粉10%，加水19%，裝袋中。溫度121℃，滅菌30min后，冷卻，用液體菌種L8500-2x接種，然后26～28℃培養(yǎng)10～15d，與等量已滅好菌的固體培養(yǎng)基混合，過篩備用，稀釋后田間噴撒。

2.2 綠僵菌L8500-2x菌劑田間生物防治試驗結(jié)果與分析

2.2.1 綠僵菌L8500-2x菌劑防治馬鈴薯28星瓢蟲藥效試驗結(jié)果與分析

根據(jù)計算結(jié)果（表3）綠僵菌L8500-2x菌劑10倍稀釋液、20倍稀釋液防治馬鈴薯28星瓢蟲一代幼蟲效果均明顯，7d后防效分別達82.4%、78%，在實際應(yīng)用中，考慮到經(jīng)濟成本核算，選綠僵菌菌劑20倍稀釋液用于大田試驗示范推廣應(yīng)用。

2.2.2 綠僵菌L8500-2x菌劑防治土蝗田間藥效試驗結(jié)果與分析

根據(jù)計算結(jié)果（表4-6），綠僵菌L8500-2x菌劑10倍液3個區(qū)平均防效達80%、20倍液3個區(qū)平均防效達75%，其中10倍液防治率最高達81%，2個處理防治蝗蝻（1～2齡）效果均顯著，達到了土蝗的防控目標，建議防治低齡蝗蝻用20倍菌液，防治大齡爆發(fā)性土蝗用10倍菌液。

2.2.3 固體培養(yǎng)綠僵菌L8500-2x菌粉防治土蝗田間試驗結(jié)果與分析

結(jié)果表明，液體培養(yǎng)綠僵菌L8500-2x菌劑防治蝗蟲效果比固體培養(yǎng)L8500-2x菌粉的防治效果要高，但菌液不好保存，固體發(fā)酵菌粉好保存，防治效果也明顯。所以綠僵菌生物農(nóng)藥的生產(chǎn)目前普遍采用液固雙相發(fā)酵工藝。

3 試驗結(jié)論與討論

通過本研究探索了固體培養(yǎng)綠僵菌L8500-2x菌株的最佳培養(yǎng)基配方及工藝條件，進行了田間試驗示范推廣，為有效利用綠僵菌合理防治防治馬鈴薯28星瓢蟲及防治田間蝗蝻（1～2齡）提供科學參考。

生物農(nóng)藥代替化學農(nóng)藥的呼聲日益高漲[10]、其利好也不言而喻，但是目前一些國家的生物農(nóng)藥產(chǎn)量已經(jīng)達到10%，而我國產(chǎn)量僅為1%。所以加大對生物農(nóng)藥科學規(guī)范的研究、對防治效果提供科學的數(shù)據(jù)資料，才能為生物農(nóng)藥的推廣和宣傳創(chuàng)建有力保障[11]。

參考文獻

[1]張彥豐，王正浩，農(nóng)向群，等.綠僵菌侵染對東亞飛蝗中腸保護酶和解毒酶的影響[J].中國生物防治學報，2015，31（06）： 876-881.

[2]張禮生，張澤華，高松，等.綠僵菌生物農(nóng)藥的研制與應(yīng)用[J]. 中國生物防治，2006，22（s）：141-146.

[3]Loera-Corral O，Porcayo-Loza J，Montesinos-Matias R， et al.Production of Conidia by the Fungus Metarhizium anisopliae Using Solid-State Fermentation[J]. Microbial-Based Biopesticides：Methods and Protocols，2016：61-69.

[4]李增智.我國利用真菌防治害蟲的歷史，進展及現(xiàn)狀[J].中國生物防治學報，2015，31（05）：699-711.

[5]梁昌聰，彭軍，黃志，等.綠僵菌發(fā)酵工藝的研究進展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學，2009，28（06）：87-91.

[6]張婧迪，蔡明美，劉志誠，等.響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化綠僵菌固體發(fā)酵條件[J].微生物學通報，2016，43（09）：2072-2078.

[7]洪軍，林峻，杜桂林，等.牧雞對草原蝗蟲防控能力與經(jīng)濟效益研究[J].植物保護，2014，40（06）：185-188.

[8]馬麗娟.優(yōu)良綠僵菌菌株的篩選及應(yīng)用性研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學：2012：1-61.

[9]駱菊梅，邱文飛，索亞.綠僵菌油懸浮劑防治蝗蟲藥效試驗[J]. 農(nóng)村科技，2011（06）：25-26.

[10]吉用銓，陸曉峰，孫春來.4種生物農(nóng)藥防治稻縱卷葉螟藥效試驗[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2013（02）：41-43.

[11]郝東川，梁彪，譚德龍，等.生物農(nóng)藥的使用技術(shù)及注意事項[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2015，35（14）：10.

作者簡介：楊文彬（1964-），山西省醫(yī)藥與生命科學研究院高級工程師，研究方向：毒理學及藥效學研究。